[本篇论文由上帝论文网为您收集整理，上帝论文网http://paper.5var.com将为您整理更多优秀的免费论文，谢谢您的支持]       作者：朱中元1，刘建兵１，王海波１，谢 勇１，张春发２，张 颖【摘要】  目的  评价构建的结核DNA疫苗pVS85BG免疫的小鼠体外产生细胞因子和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的能力。方法  利用基因操作技术将结核菌Ag85B基因和谷胱甘肽S转移酶基因插入pVAX1载体构建表达结核菌Ag85B和GST融合蛋白的DNA疫苗pVS85BG。将雌性C57BL/6小鼠分成5组，每组20只，分别用pVS85BG、pVAX1、pIL2S和PBS分别免疫，以相同的剂量加强免疫2次，均间隔2周。另一组用BCG(105CFU)皮内注射免疫1次。每组的10只鼠在最后一次加强免疫后，无菌取脾培养，上清供检测细胞因子用。另外10只小鼠则用结核菌H37Rv经静脉攻击，于2周后取脾、肝和肺进行培养结核菌并进行菌落计数。结果  pVS85BG免疫组的鼠脾淋巴细胞的培养上清中的mIL-2和mIFN-γ的平均含量分别为(339.9±59.4)pg/ml和(432.1±74.4)pg/ml，显著高于3个阴性对照组（P<0.001），与BCG免疫组差异无显著性(P＞0.05)。5个组的平均mIL-6和mIL-10差异无显著性。pVS85BG免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌菌落数分别为(32954.2±4457.5)CFU/g，(32748.0±3634.4)CFU/g和(31741.7±7293.7)CFU/g，分别低于pVAX1、pIL2S和PBS等3个阴性对照组的相应器官的结核菌载量（P<0.001），同时也显著高于BCG免疫对照组。结论  构建的DNA疫苗pVS85BG能够刺激机体产生抗结核菌所需的Th1型免疫应答，免疫鼠抵抗H37Rv攻击的能力显著增强。        【关键词】  结核； DNA疫苗；  细胞因子；  免疫保护             【Abstract】  Objective  To evaluate the ability to produce cytokines in vitro and the protective efficacy of the mice immunized by the TB DNA vaccine pVS85BG we constructed.Methods  Plasmid pVS85BG expressing fusion protein of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and glutathione S-transferase were constructed by inserting ag85b and gst into the vector pVAX1. 20 female C57BL/6 in bred mice in 5 groups immunized with the 100μg pVS85BG， pIL2S， pVAX1， PBS and BCG(105 CFU) for 3 times with 2 weeks interval except BCG(only one injection without boost). Sera and supernatants of 10 mice in each group were determined for hIL-2， mIL-2， mIFN-γ， mIL-6 and mIL-10 by sandwich ELISA. The other 10 mice in each group were challenged by 106 CFUs M tuberculosis H37Rv and killed for culturing H37Rv from the spleens， lungs and livers.Results  The average concentrations of mIL-2 and mIFN-γ in the supernatants from pVS85BG immunized mice were (339.9±59.4)pg/ml and (432.1±74.4)pg/ml， significantly higher than those from the pVAX1， pIL2S， and PBS injected controls (P<0.001). No significantly difference has been observed for the mIL-6 and mIL-10 concentrations from the mice in all 5 groups. The average M tuberculosis loads in the spleens， livers and lungs in the pVS85BG immunized group were (32954.2±4457.5)CFU/g，(32748.0±3634.4)CFU/g and (31741.7±7293.7)CFU/g respectively. The average bacterial loads of the 3 organs in the pVS85BG immunized group were significantly lower than those of their counterparts in pVAX1， pIL2S and PBS injected groups， but they were significantly higher than those of their counterparts in the BCG immunized controls.Conclusion  TB DNA vaccine pVS85BG we constructed can induce Th1 immune response which is necessary for prevention against TB， and it has the ability to enhance protective immunity to H37Rv challenge in the immunized mice.        【Key words】  Mycobacterium tuberculosis；   TB DNA vaccine；   cytokines； immune  protection        有效控制结核病的流行，除了政府重视，加强健康教育，采取一般性的预防措施和即时发现并治愈痰涂阳性肺结核病人以外，有效预防结核病的疫苗的普遍接种是关键［1］。大量实践证明，BCG对控制原发结核、降低粟粒性结核和结核性脑膜炎的发病率是肯定的。近十几年，世界各地进行了8次BCG现场试验，结果是矛盾的。在欧洲、加拿大和美国部分地区进行的试验保护率较高，总发病率下降70%～80%。但在美国南方和南印度的结果相反，保护效果很差［2，3］。因此，寻求安全、稳定、效果更好的结核疫苗一直是结核病和疫苗专家工作的重点。本研究利用基因操作技术，将具有免疫保护作用的蛋白Ag85B(antigen 85B)和具有使表达合蛋白稳定的谷胱甘肽-S转移酶（glutathione S-transferase， GST）的基因连接，插入美国FDA推荐可用于人体的表达载体pVAX1中，构建表达结核菌保护抗原Ag85B与GST的融合蛋白的真核表达载体。提取并纯化该质粒后，免疫纯系近交系C57BL/6小鼠，免疫小鼠抵抗经静脉注射结核菌H37Rv攻击的能力显著增强。报告如下。        1  材料与方法        1.1  材料        1.1.1  结核菌H37Rv标准株（ATCC27294）  由武汉大学医学院免疫学系刘君炎教授赠送。其毒力通过定期小鼠体内传种维持。结核菌传种在改良罗氏(Lowenstein-Jensen Medium，L-J)培养基进行。        1.1.2  pVAX1真核表达载体  美国Invitrogen公司产品，由美国国立卫生研究院张颖研究员提供。其基因序列及多克隆位点见该公司网站资料［4］。        1.1.3  Gex-2T载体  大连宝生物公司提供。        1.1.4  大肠埃希氏菌（Escherichia coli）DH5α及JM109菌株  华南热带农业大学生物中心保存菌株。        1.1.5  Ex Taq DNA酶，LA Taq DNA多聚酶，10×PCR缓冲液，dNTPs，限制内切酶Xba I，Hind Ⅲ，Pme I，Not I，Nhe I等  均由大连宝生物公司提供。        1.1.6  PCR试剂等  PCR 产物回收试剂盒，DNA连接试剂盒，λ-Hind Ⅲ DNA Marker，DNA Marker DL2000等均为大连宝生物公司提供。        1.1.7  BCG  上海生物制品研究所生产。        1.1.8  C57BL/6小鼠  购自北京维通利华实验动物公司。均为雌性，购买时6～8周龄，初次免疫时8～10周龄。动物在实验期间，饲养在无特殊病原体条件。该公司提供的C57BL/6小鼠的核心种群来源于Charles River Laboratories（Wilmington，Mass，USA）。        1.1.9  hIL-2、鼠白细胞介素-2（murine interleukin-2，mIL-2）、鼠干扰素γ（murine Interferon γ，mIFN-γ）、鼠白细胞介素-6（mIL-6）和鼠白细胞介素-10（mIL-10）ELISA法定量测定试剂盒  法国Diaclone Research公司（1， bd A. Fleming， 25000 BESANCON， France）产品。        1.1.10  胎牛血清（FCS）  为广州暨南大学生物技术研究所提供进口分装胎牛血清。        1.1.11  RPMI 1640培养基  Gibco公司产品。RPMI1640完全培养基的配制：临用前，10ml FCS与90ml RPMI培养液混合即可。        1.1.12  酶免疫读数仪  芬兰Labsystem公司生产的Wellscan MKⅡ型。        1.2  方法        1.2.1  结核菌基因组DNA的提取  见文献［5］。        1.2.2  表达载体的构建过程  见图1。        (1)根据实验需要设计合成下列引物。GST-P7：5′-AGT TCT AGA GCC GCC GCC ATG TCC CCT ATA CTA GGT TAT TG-3′(41Mer)。除下划线部分为Xba Ⅰ酶切位点外，其余部分均同GST-P5。GST-P8：5′-A GCT TTG TTT AAA CTA GTC AGT CAC GAT GCG GCC GCT-3′(37 Mer)。下划线部分为Pme Ⅰ酶切位点。Ag85B-P5： 5′-TCA TAT AAG CTT AGC GGC CGC GCC GCC GCC ATG ACC GCG GGC GCG TTC TCC-3′（51Mer）。下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点。双下划线部分为N

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