[本篇论文由上帝论文网为您收集整理，上帝论文网http://paper.5var.com将为您整理更多优秀的免费论文，谢谢您的支持]【摘要】  目的  探讨应用流式细胞术(FCM)检测恶性肿瘤病人外周血淋巴细胞多项免疫指标的变化及该指标对恶性肿瘤免疫治疗前后的临床价值。方法  采用流式细胞术检测50例恶性肿瘤病人和31例健康人的外周血CD3、CD4、CD8等八项免疫指标变化，并且对其中10例病人应用免疫制剂治疗前后对抗原表达的结果进行比较。结果  恶性肿瘤病人免疫功能紊乱：(1)细胞免疫和体液免疫功能低下；(2)活化T淋巴细胞明显增多(P<0.01)；(3)接受免疫治疗的病人治疗前后差别有统计学意义(P<0.01)。结论  用流式细胞仪检测淋巴细胞抗原为临床观察肿瘤病人的免疫状态提供有效的依据，免疫治疗可激活T淋巴细胞而改善免疫功能。        【关键词】  恶性肿瘤；流式细胞仪；淋巴细胞；CD；免疫治疗        【Abstract】  Objective  To explore the application of flow cytometry for the changes of multiple immune indexes in peripheral blood of malignant tumor patients and the clinic value of the indexes for the immunotherapy of malignant tumor.Methods  Flow cytometry was employed for determining eight indexes，including CD3、4、8，et.of 50 malignant tumor patients and 31 healthy persons.Furthermore，the results before and after immunotherapy of 10 patients were compared.Results  Immune function of malignant tumor patients is generally disordered.1.Both the cell immunity and the body fluid immunity are low.2.The level of active T lymphocytes are greatly high with the control(P<0.01).3.For the ten cases who received immunotherapy，which have statistic difference compared by that before the course(P<0.01).Conclusion  Determining lymphocytes antigens by flow cytometry provides an effective basis for evaluating the immune function of tumor patients in clinic.Immunotherapy can be active T lymphocyte so as to improve immune function.        【Key words】  flow cytometry；  malignant tumor；  lymphocyte；  cluster of differentiation(CD)；  immunotherapy        恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关。运用流式细胞术的方法，检测T淋巴细胞表面抗原(CD3、CD4、CD8)，B淋巴细胞表面抗原(CD19、CD20)，NK细胞表面抗原(CD16+56)在恶性肿瘤病人外周血中的表达，并检测活化T、B、NK淋巴细胞的免疫指标(CD3/HLA-DR、CD3/CD25)的变化，探讨淋巴细胞在肿瘤中的表达状况及其意义，并进一步分析恶性肿瘤病人免疫治疗前后的免疫功能改变，以致使我们更深一层认识肿瘤在细胞水平的免疫功能。        1  资料与方法        1.1  研究对象  2003年8月～2004年5月本院肿瘤科病房50例恶性肿瘤病人，均经病理确诊，其中肺癌23例，肝癌6例，乳癌4例，胃癌5例，胰腺癌2例，淋巴瘤4例，结肠癌3例，鼻咽癌1例，肾癌2例。男28例，女22例，年龄29～65岁，平均57岁。其中10例(肺癌6例，淋巴瘤4例)年龄29～53岁，平均41 岁，经免疫增强剂(高聚生4ml静滴，每日1次，共3个月；白介素Ⅱ30万U皮下注射，每周2次，共3个月)治疗一疗程(3个月)后，复查一次。        对照组31例为健康体检者，男18例，女13例，年龄36～50岁，平均43岁，其中年龄和性别构成比与病人组差异无显著性(P＞0.05)。        1.2  材料与仪器  小鼠抗人单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD19、CD20、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25及同型对照、红细胞裂解液(Optilyse C)均为法国Immunotech公司出品。流式细胞仪(Epics XL·MCL)是美国BECKMAN  COULTER公司生产。        1.3  研究方法  使用直接免疫荧光标记全血溶血法，流式细胞仪测定肿瘤病人外周血淋巴细胞表面抗原表达。        1.3.1  淋巴细胞表面标记  取荧光标记单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25、CD19、CD20各10μl放入试管中，分别加入外周全血100μl，室温避光孵育15min。并作同型对照。        1.3.2  溶血  加入Optilyse C 500μl，混匀，室温避光10min。        1.3.3  洗涤  离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，混匀。重复洗涤1次。        1.3.4  重悬  加入1ml PBS，混匀，制成单细胞悬液。        1.3.5  检测  上机，每个样品检测5000个以上细胞，用FCM软件分析，计算淋巴细胞中各标记细胞的百分率。最后所有数据应用SPSS进行统计学处理。        2  结果        对50例恶性肿瘤病人与31例健康体检者进行外周血淋巴细胞表面抗原FCM检测，做统计学分析，结果见表1。        对10例肿瘤病人在免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T淋巴细胞抗原的表达进行了FCM测定，发现CD4+、CD3+、CD4/CD8比值、CD3+/CD16+56+、CD3+/HLA-DR+、CD3-/HLA-DR+治疗前均较治疗后有显著性升高((P<0.01)，见表2。 表1  病人组与对照组淋巴细胞表面抗原及T淋巴细胞活化抗原表达的比较  (%，x±s) 注：与对照组相比，* P<0.01，** P<0.05表2  10例肿瘤病人免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T细胞抗原表达的变化  (x±s) 注：与治疗后相比，*P<0.01        3  讨论        肿瘤不是一个简单的疾病过程，肿瘤免疫更是一个复杂的过程。恶性肿瘤病人往往免疫功能状态紊乱和低下，而免疫状态在一定程度上可预示着肿瘤的发展和预后［1］。由于肿瘤免疫过程复杂特异蛋白少，或是肿瘤细胞或蛋白样物质掩盖了肿瘤抗原，使目前检查手段和蛋白分离方法尚不能检出肿瘤抗原。而通过实验性动物和对人类恶性肿瘤病人大量研究表明：免疫系统的所有有效应成分均对消除肿瘤细胞、控制肿瘤生长有作用，发挥免疫功能的淋巴细胞约占白细胞总量的20%，可分为T、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。通常采用单克隆抗体来分析细胞表面抗原分子，并对其分化群(簇，clusters of differentiation)进行了定义，用CD来描述白细胞表面抗原的不同成分。这样通过对恶性肿瘤病人相应免疫指标(CD分子)的检测，可对恶性肿瘤病人的预后进行判断并指导治疗和观察转归［5～7］。        3.1  T淋巴细胞及表面抗原(CD4、CD8、CD3)与肿瘤的关系  大量研究工作已证实，宿主对机体内发生的肿瘤组织有自发性抵抗现象，而且以细胞免疫为主［8］。众所周知，机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞的主要功能是调节蛋白质抗原引起的所有免疫应答，并清除细胞表面抗原或细胞内微生物的效应作用。T淋巴细胞进一步分化为辅助性T淋巴细胞(Th，CD4+/CD3+)和细胞毒性T淋巴细胞(Ts，CD8+/CD3+)，对于抗原刺激的应答，辅助性T淋巴细胞分泌细胞因子。细胞因子可促进T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞的增殖和分化。McMichael认为［9］T淋巴细胞作为细胞免疫调节的中心枢纽，Th和Ts细胞之间的平衡是通过CD4+和CD8+细胞之间的百分比表达出来的，其值下降表示免疫状态受抑制。目前研究还发现，CD4+细胞在协同杀伤肿瘤细胞中起着重要作用［18］，CD4+细胞数减少可使肿瘤细胞发生免疫逃逸［10，11］。亦有学者认为机体发生肿瘤时，在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱，表现为局部的CD8+亚群增高或降低，或识别肿瘤抗原上发生障碍，但恶性肿瘤病人的免疫功能直到很晚才发生［12］。对于大多数肿瘤细胞来说，肿瘤细胞表达CD8+而不是CD4+，CD4+不能辨认肿瘤细胞，而是依赖于抗原提呈细胞，如果相关的肿瘤抗原被巨噬细胞提呈(DC)，则对CD4特异性激活后才分泌淋巴因子激活CTL细胞、巨噬细胞和B细胞，产生其他淋巴因子和淋巴毒素和肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子可溶解肿瘤细胞。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人进行外周血FCM检测，肿瘤组CD3、CD4+/CD3+、CD4/CD8比值明显低于对照组，肿瘤组CD8+/CD3+

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