ot I酶切位点。斜体部分为Kozak序列。添加有起始密码子ATG。Ag85B-P6： 5′-GAT TCT AGA TCA GCC GGC GCC TAA CGA ACT CTG C-3′（34 Mer）。下划线部分为Xba Ⅰ酶切位点。斜体下划线部分为终止密码子。引物Ag85B-P5和Ag85B-P6分别为结核菌Ag85B基因［6，7］（Ag85B，也称MT85B， fibronectin binding secreting protein， Genbank Accession Number： X62398）的109-126位和958-978位碱基序列，扩增物长度约为900bp。表达产物为Ag85B成熟蛋白。Ag85B-F：5′-AAT GAT CTT GGC CGC CTA CC-3′(20 Mer)。为Ag85B基因516-535位DNA片段与Ag85B-F引物序列完全互补。为测序引物。(2)将TB-V7［8］质粒用Xba I和Hind III双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收目的p-IL2S-2。(3)以TB-V2［8］质粒为模板，Ag85B-P5/ Ag85B-P6为引物，使用PyrobestTM DNA Polymerase PCR扩增目的片段Ag85B DNA。(4)将PCR扩增片段Ag85B DNA用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收。将回收后的片段用Xba Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收Ag85B DNA 片段a。(5)使用 DNA Ligation Kit中的Solution Ⅰ，将Ag85B DNA片段a和p-IL2S-2 DNA在16℃水浴中进行连接，热转化至E.coli Competent Cells DH5α中，涂布平板，过夜培养菌体。(6)挑选阳性菌落。培养增殖细菌，提取质粒，质粒命名为TB-V7-2。(7)将TB-V7-2质粒使用Xba I和Hind Ⅲ进行双酶切鉴定。(8)将TB-V7质粒分别使用T7 Promoter/pcDNA3.1R引物进行测序。测序结果均与参考序列一致。(9)将TB-V7-2质粒用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收目的TB-V7-2 DNA。(10)以TB-V5［8］质粒为模板，GST-P7/GST-P8为引物，使用 PyrobestTM DNA Polymerase PCR扩增目的片段GST DNA。(11)将PCR扩增片段GST DNA用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收。将回收后的片段用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收GST DNA片段b。(12)使用DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，将GST DNA片段b和TB-V7-2 DNA在16℃水浴中进行连接，热转化至E. coli Competent Cells DH5α中，涂布平板，过夜培养菌体。(13)挑选阳性菌落。培养增殖细菌，提取质粒，命名为pVS85BG。(14)pVS85BG质粒使用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ进行双酶切鉴定。(15) pVS85BG质粒分别使用Ag85B-F/pcDNA3.1R引物进行测序。图1  pVS85BG疫苗的构建及酶切位点示意图    1.2.3  质粒DNA的提取及纯化  见文献［5，9］。        1.2.4  C57BL/6的免疫程序  共分pVS85BG免疫组、pVAX1注射组、pIL2S［8］注射组、PBS对照组及BCG对照组，共5组，每组20只，其中10只小鼠用于脾淋巴细胞体外产生细胞因子试验，余下的10只用于观察疫苗免疫小鼠抵抗H37Rv攻击的试验。免疫方法：将各种抗结核DNA疫苗浓缩制剂用pH 7.2的无热源0.1M PBS稀释至1000μg/ml，取0.1ml分四点注射入每只小鼠腿部肌肉内，pVS85BG免疫组、pVAX1注射组、pIL2S注射组、PBS对照组，分别在0、15和30天分别免疫或者注射1次，共3次。BCG按要求皮内注射免疫，每只小鼠105个CFU。只免疫1次。        1.2.5  小鼠脾淋巴细胞的培养及上清收集  免疫组小鼠和各对照组小鼠经挑除眼球收集血清后断颈处死，用75%酒精消毒皮毛，无菌操作取脾称重，去筋膜，研磨成匀浆，加适量不完全RPMI 1640，纱网过滤，计数淋巴细胞数目，用RPMI 1640完全培养基配制成106/ml，接种于24孔培养板，5%CO2环境37℃培养72h，收集培养液，离心取上清-20℃保存待检。        1.2.6  细胞因子的定量测定  以生物素-亲和素双抗体夹心法定量检测mIFN-γ为例。(1)将小鼠脾淋巴细胞培养上清、标准品（mIFN-γ： 1000pg/ml倍比稀释至31.25pg/ml）、标准品稀释液（作空白对照用）和质控品复溶液各100μL加入微孔内，均作复孔。(2)将生物素标记的抗mIFN-γ抗体用稀释液1：27.5稀释，每孔加50μl，微型混合器混匀。(3)置37℃恒温箱1h后，甩干液体，每孔加300μl洗涤液浸洗1min，共洗涤3次。(4)将工作浓度的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl加入各孔（含空白孔），37℃放置30min。(5)同前洗涤后，每孔加入100μl TMB底物避光反应15min。(6）各孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，立即用酶免疫读数仪测OD450。（7）标准曲线完成后，将各标本复孔OD的均数代入方程求得mIFN-γ的含量。hIL-2、mIL-2、mIL-6和mIL-10的测定的基本过程同mIFN-γ的测定。        1.2.7  H37Rv感染C57BL/6小鼠  根据文献［10，11］改进。简要步骤：将结核菌H37Rv株接种于L-J斜面37℃培养20天，挑取菌落，加少许生理盐水，用组织研磨器制成悬液，与麦氏比浊管进行比色，配制成2mg/ml，冻存于-20℃。取0.1ml接种L-J斜面，共接种3管，培养20～30天，计数CFU。根据CFU计数结果，用无热源及无菌生理盐水将H37Rv菌配制成107CFU/ml，每只小鼠尾静脉注射0.1ml（106个结核菌）感染小鼠。        1.2.8  感染鼠组织器官的结核菌培养及计数  小鼠感染结核菌后喂养15天后杀鼠，无菌取出肝、肺和脾，称重、制备成匀浆。分别取原液、1：10和1：100稀释液各0.1ml接种于L-J培养基斜面，每只鼠的每个器官的每种浓度各接种3管，37℃培养20～30天后，观察并计数L-J斜面培养基上的结核菌菌落数。计算公式如下。        S（CFU）=C×(O+V)/O×10×相应管的稀释倍数        C：3个L-J培养管出现的菌落数的均数。如果为原液接种的3管的均数，则稀释倍数为1；如果为1：10稀释管的均数，则稀释倍数为10；如果为1：100稀释管的均数，则稀释倍数为100。        10：接种量为0.1ml，相当于1/10g，为常数。乘以10为每g器官里的结核菌数。        O：为器官的重量（g）。        V：为加入生理盐水的体积。1ml=1g。        S：为每只鼠的结核菌个数，单位为CFU/g。         1.2.9  统计学方法  pVS85BG疫苗免疫组与各对照组的细胞因子和脏器结核菌落数比较采用单向方差分析。两两之间的均数比较采用q检验。分析工具为SPSS10.0系统。        2  结果        2.1  表达结核菌Ag85B与GST融合蛋白表达载体的构建及鉴定  该质粒转化后，经蓝白菌斑及卡那霉素抗性筛选，均出现阳性克隆。质粒的酶切鉴定，电泳结果表明，经相应酶切割后电泳分析的结果与设计插入的目的基因片段大小一致。见图2。        DNA测序分析的结果显示，在Ag85B和GST基因之间，加入了Xba I的酶切序列TCT AGA，因此，在连接部位表达了相应的Ser-Arg 2个aa。与设计相符合。对比文献中的序列［6，7］和我们测序分析的结果，Ag85B和GST基因序列与文献报道完全一致。图2  PCR产物及表达载体及其酶切电泳分析结果    M： DNA marker；1、结核菌ag85b的PCR产物；2、经酶切的ag85b的PCR产物；3、gst的 PCR产物；4、经酶切的gst的PCR产物；5、pVAX1的酶切回收产物；6、为pVS85BG质粒；7、质粒pVS85BG经Xba Ⅰ和Hind Ⅲ产物；8、质粒pVS85BG经Xba Ⅰ和Pme I酶切产物        2.2  结核DNA疫苗的含量及纯度  提取的pVS85BG疫苗、pVAX1和pIL2S用紫外分光光度计测得的OD260/OD280的比值为1.787、1.842和1.754，表明纯度达到要求。3种质粒的浓度分别为1675.6、1.234和1.356μg/ml，免疫时均稀释至1000μg/ml使用。        2.3  免疫组及对照组小鼠的培养上清的细胞因子含量对比  pVS85BG免疫组的C57BL/6小鼠血清中的平均hIL-2与BCG免疫对照组、pIL2S、pVAX1和PBS等3个阴性对照组的平均hIL-2含量差异无显著性。其脾淋巴细胞培养上清的mIL-2和mIFN-γ的平均含量与BCG阳性对照组的平均浓度差异无显著性，而显著高于pIL2s、pVAX1和PBS等3个阴性对照组的平均浓度（P<0.001）。培养上清中的mIL-6和mIL-10的平均浓度在5个组之间差异无显著性。见表1。表1  结核DNA疫苗免

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