谢炯炯
(江苏省海门市农产品质量检测中心 南通 226100)
摘 要: ELISA (酶联免疫吸附法)测定畜产品中违禁药物克伦特罗残留量影响因子实验结果表明，德国拜发与北京望尔生产的两种ELISA试剂盒具有操作简单、时间短、成本低、敏感度高等特点。在室温20-22℃条件下，试验制备过程中必须做到控温度、控转速、控流速及洗板过程中须做好的5个注意事项，这样可大大提高在实际操作过程中检测的准确性。
关键词: ELISA (酶联免疫吸附法); 畜产品;克伦特罗; 残留量; 影响因子
前 言：克伦特罗俗称“瘦肉精”，是国家明令禁止使用在动物产品上的药物之一，目前ELISA (酶联免疫吸附法)是快速筛选检测动物肌肉、肝脏、尿液等样品中克伦特罗残留的方法之一，与高效液相色谱,气相色谱,气质联用仪器分析相比，它具有操作过程简单，样品前处理快捷；可同时分析多个样品,分析时间短、成本低、敏感度高且对环境的污染少等优点，但在实际应用过程中涉及样品的处理、试剂准备、加样、温育、显色、结果判定等较多方面，其中任何一个步骤的操作不当都会影响最终的测定结果。为此，笔者于2006年7月期间进行了ELISA测定畜产品中克伦特罗残留量影响因子及不同试剂盒回收率差异度试验
研究，取得了较为理想的结果，现将结果报道如下：
2 实验部分
2.1实验原理
ELISA（酶联免疫吸附测定法）测定克伦特罗残留量是利用抗原抗体的特异性反应，以酶催化底物等方法作为显示系统，用微孔板等作为反应、分离载体的一种生物学检测方法。
2.2仪器
美国BIO-RAD550型酶标仪、单道移液器20、100、1000、5000ul、多道移液器300ul、德国拜发C18柱、离心机、振荡器
2.3试剂
甲醇（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、正己烷（分析纯）、50mM盐酸[3]、pH3.0 50mM磷酸二氢钾缓冲液[3]、pH3.0 500mM磷酸二氢钾缓冲液[3]
2.4试剂盒
试剂盒A： 96孔酶联板、克伦特罗系列标准溶液（浓度为0、100.0、300.0、900.0、2700.0、8100.0ug/L），抗体工作液、酶标记物工作液、发色剂、反应停止液、缓冲液（德国拜发克伦特罗检测试剂盒）
试剂盒B： 96孔酶联板、克伦特罗系列标准溶液（浓度为0、100.0、300.0、900.0、2700.0、8100.0ug/L），抗体浓缩液、酶标记物工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。（北京望尔生物技术有限公司克伦特罗检测试剂盒）
2.5 试样的制备
尿液
取离心或过滤至清亮的猪尿直接测定
猪肝
用均质器均质样品,取5g粉碎样品,加入25ml 50mMHCl混合,振荡2小时,达到均质,取6g均质品加入离心瓶, 在10-15℃条件下离心15分钟，每分钟/4000转以上，转移上清液到另一个离心瓶,加入300ul 1N氢氧化钠混合15分钟，加入4 ml 500mM磷酸二氢钾缓冲溶pH3.0，混合在4℃保存12小时。在10-15℃条件下离心15分钟，每分钟/4000转以上,分离上清液，温度升至室温，上柱，
用3 ml甲醇洗涤柱子，流速为1滴/每秒、用 2 ml pH3.0 50mM磷酸二氢钾缓液洗涤柱子、样品进柱子、再用2 mlpH3.0 50mM磷酸二氢钾缓液洗涤柱子、用空气或氮气吹2分钟干燥柱子，用1 ml甲醇洗涤柱子，在50-60℃弱空气下蒸发溶剂，用1 ml蒸馏水溶解干燥的残留物，待测定。
ELISA实验分析程序
将试剂盒温度平衡至室温20-22℃，取出实验所需微孔布板，向酶标板孔中依次加入标准品和样品各20ul，分别依次加入克伦特罗抗体37℃环境中反应30分钟，洗板、加入酶标记物，37℃环境中反应30分钟，洗板，加入底物37℃环境中反应15分钟，加入反应终止液，放入酶标仪450nm处进行读数，最后进行计算和处理，样本吸光值与其所含克伦特罗成负相关。所获得的标准值和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100%。
百分吸光度值（%）＝B/B0 X 100%
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值。
计算的标准值绘成为一个对应克伦特罗浓度（µg/L）的半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度（µg/kg）可以从校正曲线上读出浓度；浓度为0、100.0、300.0、900.0、2700.0、8100.0ug/L，相对应的吸光度为1.711、1.489、1.348、0.839、0.548、0.285计算出对应浓度对数，绘制相应的半对数坐标系统曲线图，读出浓度;或者用酶标仪专用软件进行直接计算和
处理，更加有利于大量样品的准确、快速分析。在以上试验制备过程中，要做到“三控”控温度、控转速、控流速。控温度时应做到：控制室温20-22℃、温育时恒温箱内温度始终保持在37℃环境、样品离心时温度保持在10-15℃；控转速时应做到：样品离心时速度为15分钟/4000转，是影响准确率的重要因子；控流速应做到：控制试剂和样品上柱时流速为1滴/1秒、15滴/1分钟，这是前处理步骤中十分关键的注意点。在进行洗板操作时一般应注意以下几个方面：
Ⅰ、甩干孔内反应液
Ⅱ、洗涤液在板孔上方1cm处注入，相互不得溅溢
Ⅲ、洗涤液数量保证控制在250ul以上，放置10秒左右
Ⅳ、吸干孔内液体，在吸水纸上拍干，次数为3次以上
Ⅴ、洗板后应立即进行下一步操作，并保证枪头与移液器的紧密接触
在分析程序中，洗板虽不是反应步骤，但也是决定实验成败的关键因子之一。目的是吸去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。通过上述方法可以很好提高酶联免疫分析的准确性，将吸光度变异系数控制在有效范围内，并将添加回收率控制在有效范围内，确保分析数据的准确性。
5结果与分析
表1、不同试剂盒吸光度变异系数试验结果表 （单位ug /L）
处理项目 | 0.1 | 0.3 | 0.9 | 2.7 | 8.1 |
Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ |
试 剂 盒 A | 吸光度 | 1.916 | 1.971 | 1.944 | 1.558 | 1.428 | 1.493 | 0.985 | 0.874 | 0.929 | 0.436 | 0.390 | 0.431 | 0.233 | 0.222 | 0.228 |
浓度均值 | | 0.1 | | | 0.3 | | | 0.899 | | | 2.709 | | | 8.060 | |
变异系数(%) | | 0 | | | 0 | | | 0.1 | | | 0.3 | | | 0.5 | |
试 剂 盒 B | 吸光度 | 1.748 | 1.883 | 1.816 | 1.224 | 1.259 | 1.241 | 0.711 | 0.688 | 0.700 | 0.363 | 0.376 | 0.369 | 0.201 | 0.203 | 0.202 |
浓度均值 | | 0.099 | | | 0.300 | | | 0.901 | | | 2.689 | | | 8.088 | |
变异系数(%) | | 0.1 | | | 0 | | | 0.1 | | | 0.4 | | | 0.2 | |
备注:Ⅲ代表平均值
从表一可以看出,试剂盒浓度为0.1-8.1ug /L时, 德国拜发试剂盒与北京望尔试剂盒变异系数分别为0-0.5%与0-0.4%之间，这说明在相同的条件下，两种试剂盒对克伦特罗均具有较高的灵敏度。
表2、两种不同试剂盒添加回收率试验结果表 （单位:ug/kg， ug /L）
样品名称 | 猪肝 | 猪尿 |
添加浓度 | 1 | 0.25 |
回收率(%) | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ |
试剂盒A | 76.9 | 75.3 | 79.4 | 77.2 | 88.0 | 83.1 | 85.0 | 85.4 |
试剂盒B | 61.03 | 63.0 | 70.0 | 64.7 | 114.9 | 108.0 | 87.0 | 103.3 |
备注: Ⅳ代表平均值
从表2可以看出两种不同厂家生产的试剂盒在测定克伦特罗残留量时，添加浓度1.0ug/kg、0.25 ug/L时，添加回收率均能达到61.03-114.9%之间，属有效范围，均可用于生产实际中。二种试剂盒对猪尿敏感性均较好于猪肝，德国拜发生产的试剂盒添加回收率稳定性略高于北京望尔公司生产的试剂盒。
6小结
6.1从本次试验结果可以看出，酶联免疫吸附法具有操作简单、灵敏度高、成本低、可批量检测等优点，适合县级畜产品质量检测机构进行快速测定使用。
6.2影响试剂盒测定准确率的因子多种多样，但最主要的影响因子为试验制备过程中的温度、转速、流速，同时在洗板过程中必须做到5个注意事项以提高检测准确率。
6.3本次试验未与高效液相色谱及气质联用色谱法同步跟踪，其关联性还有待于进一步
研究。
7参考文献
[1]食品卫生检验方法 理化部分（二） 北京：中国标准出版社2004,2
[2]仲德昌,吕志平,胡小云,等.进出口食品中农药残留实用检测方法[M].北京:中国标准出版社,2004,12.47-49.
[3]楼书聪,杨玉玲.化学试剂配制手册[M].第2版.南京:江苏科学技术出版社,2002,11.
作者简介：谢炯炯（1984-），女，江苏海门人，助理畜牧师，从事（农）畜产品质量检测工作。
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