[本篇论文由上帝论文网为您收集整理，上帝论文网http://paper.5var.com将为您整理更多优秀的免费论文，谢谢您的支持]【摘要】  目的  探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)对人胃癌MGC-803细胞株增殖的影响及其分子机制。 方法  采用MTT法测定EGCG对胃癌细胞增殖的抑制作用；运用免疫细胞化学和免疫印迹技术分别检测c-Myc和磷酸化Erk1/2蛋白表达改变。 结果  EGCG对MGC-803细胞增殖具有抑制作用，呈浓度依赖性。EGCG处理后免疫细胞化学检测c-Myc蛋白的表达下调，免疫印迹检测磷酸化Erk1/2蛋白表达下调。 结论  EGCG抑制MGC-803细胞增殖，呈浓度依赖性，其抑制肿瘤细胞增殖的效应与抑制Erk1/2蛋白磷酸化及下调c-Myc蛋白有关。        【关键词】  EGCG； 胃肿瘤；   c-Myc；  Erk1/2                【Abstract】  Objective  To probe the effects of green tea extract epigallocatechin-3-gallate(EGCG) on proliferation of human gastric cancer cell line MGC-803 and its molecular mechanisms. Methods  MTT assay was used to test the inhibitory effects of EGCG on proliferation in MGC-803 cells. Expression of c-Myc in MGC-803 cells was detected by immunocytochemistry.The expression of phosphorated Erk1/2 protein in MGC-803 cells was examined using Western blot analysis.Results  MTT assay has shown that EGCG significantly inhibited proliferation of MGC-803 cells in a concentration dependent manner.Immunocytochemistry detected the expression down regulation of c-Myc protein analysis treated with EGCG for 48 hours in MGC-803 cells.Western blot analysis confirmed the expression of phosphorylated Erk1/2 protein significantly down regulated.Conclusion  EGCG inhibits proliferation of MGC-803 cells in a concentration dependent manner and its mechanism associated with the down regulation of c-Myc and phosphorylated Erk1/2 proteins expression.         【Key words】  EGCG；gastric neoplasm；c-Myc；Erk1/2        近年来，研究开发天然植物药抗肿瘤已成为有前景的新领域，并取得了可喜成绩，如：羟基喜树碱、三尖杉酯碱等对肿瘤细胞有明显抑制作用，并已研制出用于临床的制剂［1，2］。茶是一种由山茶科植物的叶片经一定的工艺制作成的饮料。研究发现绿茶及其提取物具有清除氧自由基、抗氧化、抗突变、抗炎抗病毒和抑制肿瘤生长等众多功效［3～5］。流行病学调查表明常饮绿茶与肿瘤的低发生率有关［6］。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3- gallate，EGCG）是绿茶的主要成分之一。本试验观察EGCG对人低分化胃腺癌MGC-803细胞株生长的影响，初步探讨EGCG抑制胃癌细胞增殖的分子机制。        1  材料与方法        1.1  药品试剂  EGCG（Sigma公司产品，纯度95%）购自北京鼎国生物技术有限责任公司，EGCG用磷酸盐缓冲液溶解，配成5mg/ml，0.22μm微孔滤膜抽滤除菌，4℃保存；培养基RPMI－1640（Gibco公司产品）；小牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）；c-Myc抗体、S-P试剂盒、DAB试剂盒均购自福州迈新公司（美国MAXIN公司产品）；Erk1/2抗体、磷酸化Erk1/2抗体购自基因公司（Santa Cruz公司产品）。        1.2  细胞培养  人胃癌MGC-803细胞株，由中南大学湘雅医学院肿瘤所引进，系山东师范大学培育的人胃低分化黏液腺癌。本所保种、传代，培养基为RPMI－1640，抽滤除菌，临用前加10％小牛血清，细胞培养于37℃、5％体积分数CO2培养箱中。        1.3  MTT法测定细胞增殖抑制作用  取对数增长期细胞，消化后调整细胞密度至3×104/ml，96孔板每孔种细胞悬液180μl，6h后加不同浓度EGCG（20μl），试验设5个不同浓度组（终浓度为100μg/ml、80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml），调零组和空白对照组加等体积PBS，加药后继续培养48h，每孔加MTT（5mg/ml）20μl，调零组不加MTT。共同孵育4h后，吸尽培养板内液体，每孔加DMSO 150μl，震摇10min，置酶联免疫检测仪测定A570值。        1.4  免疫细胞化学  取对数生长期细胞常规消化后接种于含灭菌盖玻片的六孔板中，培养6h后加入处理因素（EGCG终浓度60μg/ml），培养48h，取出贴附细胞的盖玻片，按照S-P试剂盒说明操作。依次进行固定，过氧化物酶阻断，非免疫动物血清封闭，孵育一抗，孵育二抗，DAB显色，苏木素衬染，酒精梯度脱水，中性树胶封片。        1.5  免疫印迹  细胞培养后用悬浮裂解液于冰上裂解细胞，10000r/min离心10min，取上清液，BCA蛋白定量试剂盒调整蛋白至相同浓度。样品加入等体积2×SDS加样缓冲液，沸水煮沸5min，经SDS-PAGE胶电泳后转膜；封闭液封闭2h；加一抗（用封闭液稀释），4℃孵育过夜；TBST洗3次，每次15min；加相应的二抗（封闭液稀释），室温孵育1h，TBST洗3次，每次15min；用ECL发光法检测蛋白表达状况。免疫印迹所用试剂（悬浮裂解液、SDS加样缓冲液、封闭液、TBST均参照《分子克隆》配制）。        2  结果        2.1  MTT比色法测定EGCG对MGC-803细胞增殖的影响  EGCG抑制MGC-803细胞增殖，呈浓度依赖性。实验结果采用方差分析进行统计学处理。EGCG各浓度处理组与空白对照组比较，差异均有显著性（P<0.05）。数据见表1。根据公式计算IC50=58.60μg/ml。               表1  EGCG对MGC-803细胞增殖的影响  （48h，n=6）                              注：与空白对照组比较*P<0.05        2.2  免疫细胞化学检测EGCG对MGC-803细胞c-Myc表达的影响  见图1。c-Myc蛋白表达阳性的细胞其胞核为棕黄色，胞核蓝色的为c-Myc表达阴性的细胞。从图1可以看出：空白对照组大部分细胞c-Myc表达阳性，而经EGCG处理后仅少数细胞表达c-Myc。每组爬片不同部位观测5个视野，每视野计数100个细胞，统计其阳性率。EGCG空白对照组c-Myc阳性表达率为81.3%，EGCG(60μg/ml)处理组c-Myc阳性率为18.2%，两组之间经单向方差分析P<0.05，差别具有统计学意义。                     a .PBS，48h，MGC-803，c-Myc，S-P×200　b .EGCG，48h，MGC-803，c-Myc，S-P×200                  图1.免疫细胞化学检测c-Myc蛋白    2.3  免疫印迹检测Erk1/2蛋白的磷酸化水平  以总Erk1/2蛋白作为内对照。EGCG（60μg/ml）处理MGC-803细胞，随着处理时间的延长，Erk1/2的磷酸化水平逐渐减弱；不同浓度EGCG（40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml）处理MGC-803细胞48h，磷酸化Erk1/2蛋白随EGCG浓度的增大表达逐渐减弱。以总Erk1/2蛋白为内对照，总Erk1/2蛋白的表达不随EGCG处理时间及浓度的改变而发生变化。见图2。                    图2a. EGCG对MGC-803细胞Erk1/2蛋白磷酸化水平的影响（60?g/mL，不同时间）     #:与0h组相比，P <0.05(n=3)                             图2b.  EGCG对MGC-803细胞Erk1/2蛋白磷酸化水平的影响（不同浓度，48h）  #:与0?g/mL组相比，P<0.05(n=3)    3  讨论        胃癌在我国的发病率与死亡率仍居消化道恶性肿瘤之首，严重危害人民的健康与生命。目前，胃癌的有效治疗方法仍以根治性外科手术为主，早期胃癌根治性切除后5年生存率可达90％以上，但目前我国就诊的胃癌患者中大多数属中晚期，手术切除率仅为50％左右，而术后5年生存率仅有20％～30％［7，8］。胃癌的发生、发展与饮食因素关系密切。因此，寻找天然植物药对预防胃癌的发生、发展以及治疗具有重要的研究价值和广阔的应用前景。本实验运用MTT比色法检测EGCG对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响。结果显示，EGCG显著抑制MGC-803细胞增殖，EGCG（20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml，48h）处理MGC-803细胞，其抑制率分别为21.7％、32.8％、52.5％、61.3％、66.5％。各浓度处理组与空白对照组比较差异均有显著性（P<0.05）。证实EGCG对MGC-803细胞增殖有明

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