[本篇论文由上帝论文网为您收集整理，上帝论文网http://paper.5var.com将为您整理更多优秀的免费论文，谢谢您的支持]  孙 鹏，李五生，张 楠，周小娜，刘金龙                                                                               【摘要】   目的   观察葛根素（Pue）对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护作用，及其保护机制。方法   首先建立大鼠肝硬化动物模型，在此模型基础上建立大鼠全肝缺血再灌注模型，比较用Pue预处理对缺血再灌注后，肝组织光镜下的形态学改变；血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和氧化亚氮（NO）、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性，及肝组织中NO、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、MDA含量、SOD活性变化。结果   Pue预处理可使大鼠血清NO含量、肝组织NO含量及SOD活性明显增高；而血清ALT、AST、MDA含量及肝组织TNF-α、MDA含量明显降低；肝组织形态损伤也有所减轻。结论   葛根素对肝硬化大鼠肝缺血再灌注损伤有显著的保护作用，其主要机制是减少NO的降低、扩张血管、改善微循环；清除氧自由基、减轻脂质过氧化。        【关键词】   葛根素；药物预处理；缺血再灌注损伤；肝硬化；大鼠        现代肝胆外科中避免术中过多的出血，及时而有效地控制出血是手术成功的关键之一，阻断肝血流技术在肝切除术中被广泛应用。许多肝脏疾病患者往往伴有肝硬化，其硬化肝脏对缺血的耐受性较差，长时间阻断入肝血流或术中大出血均可引起I/R损伤而加重处于代偿边缘的肝脏负担，导致术后发生肝功能衰竭的可能性增大。因此寻找一种对肝硬化肝脏缺血及再灌注具有保护作用的药物及方法具有重要临床意义。以往采用的缺血预处理的方法有其缺陷并在临床应用中受到限制，故寻找一种药物预处理来保护肝组织、减轻I/R损伤具有重要的临床价值。以往试验证明葛根素对正常肝脏及其他多个组织器官的I/R损伤具有良好的保护作用。本次试验通过葛根素预处理及缺血预处理对肝硬化大鼠肝脏I/R损伤保护作用的对比，探讨葛根素是否对肝硬化大鼠肝脏的I/R损伤具有保护作用，并进一步研究其作用机制。        1   材料与方法        1.1   动物   Wastar大鼠200只，体重200～220g，雌雄各半。        1.2   仪器与试剂   奥林巴斯2700全自动生化分析仪、DY89-1全自动玻璃匀浆机、Arthos HTⅡ酶标仪、SANYO MDF-330型-70℃低温冰箱、HH21-600型恒温水浴箱、722分光光度计。CCl4，泸州市鑫达化工有限公司提供，批号20050713；食用酒，泸州市食品厂提供；葛根素注射液哈尔滨三联药业有限公司提供，批号050102B；SOD测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，黄嘌呤氧化酶法测定，批号20050716；MDA测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；TBA法测定，批号20050716；NO测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，亚硝酸盐法测定，批号20050719；TNF-α测定试剂盒，上海森雄科技实业有限公司，双抗体夹心ABC-ELISA法测定，批号20050719。        1.3   模型制备及试验方法        1.3.1   大鼠肝硬化模型制备   经大鼠腹部皮下注射CCl4大豆油溶液，前4次剂量为0.5ml/100g体重60% CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，第4次后间隔7天注射第5次（可减少大鼠死亡率），第5次起剂量改为0.3ml/100g体重40% CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，共13次；除注射CCl4当日外，每日1次60%食用酒灌胃，乙醇剂量0.4g/100g体重；给予正常饮水；以高脂低蛋白饲料喂养。上述操作第6周末停止，继续观察至8周末大鼠肝硬化模型制备成功并趋于稳定。第2周起每周末行B超定位肝穿刺病理检查，8周末挑选肝硬化程度趋于同一水平大鼠128只，继续进行下面试验。        1.3.2   动物分组   按随机数字表法，将128只大鼠随机分为4组，每组再分为4个时间亚组，每亚组8只大鼠。4组分别为A组：假手术组；B组：单纯缺血再灌注组；C组：缺血预处理组；D组：葛根素预处理组。4个时间亚组分别为a亚组：缺血前时间亚组；b亚组：缺血再灌注后1h时间亚组；c亚组：缺血再灌注2h时间亚组；d亚组：缺血再灌注6h时间亚组。        1.3.3   缺血再灌注模型的制备   术前禁食12h，自由饮水。以戊巴比妥钠3mg/100g体重腹腔注射麻醉后开腹并充分显露肝门，游离门静脉及肝固有动脉，用无损伤动脉钳给予钳夹，30min后移去动脉钳复灌60min，形成全肝I/R模型。C组于缺血前反复3次缺血5min再灌注5min形成缺血预处理模型及术前D组12h、1h分别2次分别给予Pue 10mg/100g体重，其他各组给予等量生理盐水，再行缺血30min，再灌注60min，D组形成葛根素预处理模型。        1.3.4   标本采集   B、C、D组动物在再灌注0h（即缺血前）、再灌注1h、2h、6h后分别从各时间亚组大鼠心内取血5.0ml，不加抗凝剂静置2h，并标明分组及动物编号，用自动平衡离心机离心，取部分血清测定ALT、AST的含量，其余的置入-70℃冰箱内待测定NO、SOD、MDA。取血后快速取右肝组织进行HE染色光镜观察；其他肝组织取0.5g制备10%组织匀浆，检测其中NO、SOD、MDA及TNF-α。A组亦在相对应的时间点取血及肝组织行上述检查。在实验完毕时处死动物。        2   结果        2.1   病理结果   各组低倍镜下均可见肝小叶结构紊乱，肝小叶重建，可见纤维再分隔现象，肝内假小叶广泛形成，同时伴有明显的肝细胞结节状再生等肝硬化病理表现。A组：除上述表现外未见其他异常。B组：高倍镜下可见肝细胞核边聚、浓缩及溶解，胞浆疏松化，并可见嗜酸性浸润；肝窦明显狭窄，可见大量的红细胞淤积其内并有微血栓形成、中性粒细胞贴壁等。C组：高倍镜下可见肝细胞核边聚、浓缩及溶解，胞浆疏松化，但较B组显著减轻；肝窦狭窄较轻，但仍有红细胞淤积及微血栓形成现象，炎性细胞浸润减少。D组：高倍镜下仅偶见核边聚，胞浆疏松化；肝窦无明显狭窄，内无明显红细胞淤积，及其微血栓形成等，汇管区炎性细胞浸润不明显。        2.2   血清及肝脏组织匀浆检验结果        2.2.1   各组大鼠肝功酶学指标变化   D组肝功酶学检验缺血前与其他各组无明显差异（P＞0.05），再灌注后各时间点明显降低B组（P<0.05），与C组无显著差异（P＞0.05），C、D组再灌注6h时较B组ALT、AST显著降低（P<0.05），但与A组相比未完全恢复正常（P<0.05），见表1。        表1   4组大鼠灌注后各时间点血清ALT、AST的变化   （x±s，u/L）                 注：与A组同时间点相比，▲P<0.05；与同组灌注缺血前即0h时相比，△P<0.05；与B组同时间点相比，*P<0.05        2.2.2   各组大鼠血清NO含量变化   C、D组血清NO与再灌注1h、2h含量较缺血前有所降低，但较B组下降幅度小（P<0.05）。再灌注6h时C、D组恢复正常与A组差异无显著性（P＞0.05）；而B组含量明显升高，且高于A组（P<0.05），见表2。           表2   4组大鼠灌注后各时间点血清NO的变化   （x±s，μmol/L）                   注：与A组同时间点相比，▲P<0.05，与同组灌注缺血前即0h时相比，△P<0.05，与B组同时间点相比，*P<0.05    2.2.3   各组大鼠血清SOD活性及MDA的含量变化   D组SOD活性与C组各时间点无明显差异（P＞0.05），明显高于B组（P<0.01），再灌注1h时较A组降低（P<0.05），灌注后6h时与假手术组差异无显著性（P＞0.05）。血清MDA含量，缺血再灌注1h、2h时C、D组较A组有所增高，但增高程度明显低于B组（P<0.05），再灌注6h时，D组与A组比较差异无显著性（P＞0.05）。各组大鼠各时间点的血清SOD、MDA含量变化见表3。             表3   4组大鼠灌注后各时间点血清SOD、MDA的变化   （x±s）                    注：与A组同时间点相比，▲P<0.05；与同组灌注缺血前即0h时相比，△P<0.05；与B组同时间点相比，*P<0.05    2.2.4   各组大鼠缺血再灌注后1h时肝脏中NO、MDA、TNF-α含量及SOD活性差异   肝脏组织总的NO、MDA、TNF-α含量及SOD活性与同时间点的血清中的各指标的趋势一致，即C、D组的NO含量及SOD活性显著高于B组（P<0.05），但较A组稍低（P<0.05），MDA及TNF-α含量C、D组显著低于B组（P<0.05），但较A组稍高（P<0.05），见表4。       表4   4组大鼠灌注后1h肝脏

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