[本篇论文由上帝论文网为您收集整理，上帝论文网http://paper.5var.com将为您整理更多优秀的免费论文，谢谢您的支持]           作者：段体德1，刘德权2，杨策尧1【摘要】  目的  探讨Survivin反义核酸技术诱导乳腺癌细胞凋亡的作用及效果。方法  本实验共分6组，分为以脂质体介导反义寡核苷酸组（ASODN/Lip）、无义寡核苷酸组（NODN/Lip）及RPMI 1640培养液的空白对照组（Lip），转染人乳腺癌MCF-7细胞系，应用Hoechst 33258/PI双重染色观察MCF-7细胞的形态学改变，透射电镜观察细胞超微结构，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化，DNA凝胶电泳观察凋亡情况，研究Survivin反义寡核苷酸对MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果  Hoechst 33258/PI染色及透射电镜观察可见转染后的细胞结构呈凋亡样改变；流式细胞仪检测见转染后细胞凋亡显著增加，并出现G2/M期阻滞现象；DNA凝胶电泳在600ng/ml，800ng/ml ASODN/Lip组的电泳图谱上呈现出明显的“梯状”现象。结论  凋亡抑制基因Survivin表达下调对乳腺癌细胞的生长抑制作用主要是通过诱导细胞发生凋亡以及阻止有丝分裂发生在G2/M阻滞期来实现，Survivin靶向反义核酸技术可能成为乳腺癌基因治疗的一种有效方法。        【关键词】  乳腺癌；Survivin基因；反义核酸技术；凋亡          【Abstract】  Objective  To explore the effect of cells apoptosis on human breast cancer after survivin was blocked with the antisense technique.Methods  The experiments were divided into six groups. Antisense Oligonucleotide (ASODN)， nonsense oligonucleotide (NODN) was transfected in human breast cancer MCF-7 cell line and RPMI 1640 culture medium (normal control). The study used Hoechst 33258/PI，electron microscope， flow cytometer and in gel electrophoresis of DNA to observe the cells apoptosis.Results  The cells apoptosis after transfection were observed by Hoechst 33258/PI，electron microscope and in gel electrophoresis of DNA.The result of flow cytometer showed the cells apoptosis after transfection and the blocking phenomena appeared in G2/M period.Conclusion  The restriction by the reduction of survivin expression in breast cancer cells is mainly functioned through its induction of cells apoptosis and prevention of mitosis at G2/M period. Survivin targeting therapy can be used as an important method in breast cancer treatment.        【Key words】  breast cancer；survivin gene；antisense technique；apoptosis        现代分子生物学研究发现与细胞恶性增殖和分化受阻一样，细胞凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学上亦占有重要地位。诱导肿瘤细胞发生凋亡目前正逐步成为治疗恶性肿瘤的一种重要的治疗方法，具有较高的选择性与靶向性。Survivin是近年来发现的一个新的细胞凋亡抑制基因，能够抑制肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞得以生存，在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因是肿瘤基因治疗的主要方法。在本实验研究中我们应用荧光染色、电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等技术，从细胞形态学到细胞周期、DNA变化，从定性到定量进行了研究。探讨是否可通过转染Survivin反义寡核苷酸（ASODN）诱导乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡，为乳腺癌的基因治疗提供理论实验依据。        1  材料与方法        1.1  细胞培养  MCF-7人乳腺癌细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。将加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液制成的细胞悬液，镜下计数，调节细胞至约1×106个/ml，分别接种于30ml培养瓶、96孔培养板及铺有盖玻片的6孔培养板，37℃，5%CO2常规培养至80%汇片后进行转染。        1.2  脂质体介导Survivin ASODN转染MCF-7细胞        1.2.1  寡核苷酸的设计及合成  采用Survivin mRNA 231-251设计互补ASODN，反义寡核苷酸（ASODN）序列5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′；对照无义寡核苷酸（NODN）序列5′CGCAGTAGCTGCGCTGATTG3′，对照序列经GeneBank比对无相关基因，两条序列每端5个磷酸基采用硫代磷酸型，即在合成时用硫基取代寡核苷酸片段磷酸上的羟基，部分反义寡核苷酸5FAM荧光素标记，由上海生物工程公司提供。        1.2.2  转染混合物的制备及配制  A液：Survivin反义寡核苷酸及对照序列的浓度设定为：200，400，800，1200，1600（ng/ml），用不含血清及抗生素的RPMI 1640将反义寡核苷酸配成上述浓度溶液。B液：将Lipofectin：RPMI 1640（不含血清及抗生素）=4μl∶100μl的比例配成B液。将等体积的A液与B液混合，室温下放置40min左右，使脂质体与寡核苷酸充分包裹。寡核苷酸的终浓度为100，200，400，600，800（ng/ml）。        1.2.3  转染  将不同浓度的ASODN-RPMI 1640转染混合物加入培养瓶或培养板中。本实验设6组分别为：（1）Lip组以RPMI 1640培养液代替转染混合物作为空白对照（加入Lip）；（2）无义对照（NODN）组，以NODN/Lip-RPMI 1640转染细胞作为无义对照；（3）200ng/ml ASODN转染组；（4）400ng/ml ASODN转染组；（5）600ng/ml ASODN转染组；（6）800ng/ml ASODN转染组，37℃，5%CO2常规培养24h，弃去转染混合物，胰酶消化收集细胞。96孔板中的细胞用于检测细胞贴壁率、细胞生长抑制率以及绘制细胞生长曲线。        1.3  透射电镜观察MCF-7细胞超微结构  转染接种于30ml培养瓶的细胞48h，以0.25%胰蛋白酶/0.02EDTA消化，戊二醛原位固定，琼脂包埋沉淀细胞，梯度丙酮系列脱水，Epon812系列包埋固定，超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染色，电镜下观察、拍照。        1.4  Hoechst 33258与PI染色细胞形态学观察  荧光显微镜下观察细胞核形态及颜色改变以区分出天然细胞、凋亡细胞以及坏死细胞。        1.5  流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期  细胞转染结束后培养48h，每组收集2×106个细胞，预冷的70%乙醇4℃固定24h，PBS洗涤3次，细胞重悬于0.4ml PBS中，加入10.15mg/m1的PnaseA 37℃孵育1h，1g/ml PI 4℃染色过夜，流式细胞仪检测凋亡细胞的比率和细胞周期。资料经ModFit软件分析。        1.6  DNA抽提及电泳        1.6.1  进行凋亡细胞DNA抽提  收集2×106个/ml的实验组和对照组细胞，200g离心洗涤后，按凋亡DNA提取试剂盒说明书进行实验。收取DNA，弃去无水乙醇后，用70%乙醇混匀漂洗3次，开盖室温放置15min让乙醇挥发，加入含1mmol EDTA，10mmol Tris-HCl（pH 7.8）TE缓冲液，使DNA溶解，4℃冰箱保存备用。        1.6.2  DNA琼脂糖凝胶电泳  取10μl提取的DNA样品（含1mg DNA量）与0.25%溴酚蓝和40%蔗糖溶液混匀后，加入琼脂糖凝胶样品槽内，在由1mmol/L EDTA（pH 8.0）和45mmol/L Tris-硼酸缓冲液配制的内含0.5μg/ml溴乙啶染料的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压稳定在50V，电泳1.5h后，取出标本在紫外灯下观察DNA阶梯状条带形成，结果用紫外透射仪观察，拍照。        1.7  统计学方法  本实验数据资料以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 11.0软件包进行方差分析，显著性水准为α=0.05。        2  结果        2.1  细胞形态学观察  处理后的MCF-7细胞经Hoechst 33528/PI双重染色后，表现为细胞体积缩小，细胞完整、细胞膜皱缩、染色质浓缩边聚呈新月形、细胞核固缩与断裂、核仁消失，在细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光的即为早期凋亡细胞（见图1， 2）。1坏死细胞，2正常细胞图1  NODN／Lip~]2MCF—7细胞，Hoechst 33258／PI染色后在荧光显微镜下的形态(×400)1坏死细胞，2正常细胞，3凋亡细胞图2 600ng／ml ASODN／Lip组，MCF—7细胞经Hoechst33258／PI染色后在荧光显微镜下的形态(×400)    2.2  DNA电泳结果  本实验结果显示，600ng/ml，800ng/ml ASODN在Lip

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