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介导下处理MCF-7细胞48h后，在琼脂糖凝胶电泳图谱上呈现出明显的“梯状”现象（见图3），推论ASODN在Lip介导下能诱导MCF-7细胞凋亡。 M：marker 1～6道分别为Lip组，NODN/Lip组，（200、400、600、800）ng/ml ASODN/Lip组处理图3 MCF-7细胞48h后凋亡DNA凝胶电泳图谱 2.3 流式细胞仪分析转染前后细胞周期的变化 细胞周期分析可见转染后各组G1期细胞分别为72.62%，68.26%，62.38%，54.65%，12.98%及7.01%，各转染组G1期细胞显著减少；S期细胞无明显变化；转染后各组G2/M期细胞分别为5.83%，4.98%，7.12%，12.28%，40.18%及43.82%，各转染组G2/M期细胞显著增加，出现G2/M期阻滞现象。说明Survivin ASODN能够以剂量依赖的方式诱导乳癌细胞发生G2/M期阻滞，随着ASODN的浓度增加，凋亡峰值增大，200ng/ml组凋亡峰值为（2.38±0.10）%；当浓度达到800ng/ml时，凋亡峰值为（30.16±1.68）%，与此同时G2/M期细胞所占的比例随之增加；经统计分析ASODN组不同浓度间差异有显著性（P<0.05），与Lip组和NODN/Lip组比较差异有显著性（P<0.05），这种差异均见于G1期、S期、G2/M期（见表1，图4）。 表1 转染24h后细胞周期变化（x±s，n=4，%）注：与Lip组比较，*P<0.01；与NODN/Lip组比较，△P<0.01图4 流式细胞仪检测转染Survivin ASODN前后凋亡峰及细胞周期的变化图 2.4 透射电镜观察 经反义核酸作用后48h，在600ng/ml ASODN/Lip组浓度作用发现大量的凋亡细胞，表现为细胞核边聚、核浓缩、核碎裂等（见图5，6）。 图5 透射电镜（×3000）示凋亡细胞，染色质凝集成团块状部分并附着在核膜上 图6 透射电镜（×3000）示凋亡细胞染色质边聚，形成新月状 3 讨论 基因治疗是恶性肿瘤的最新治疗手段，随着对细胞凋亡调控异常在肿瘤发病学中的重要性的认识，在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因已经构成肿瘤基因治疗中最诱人的策略之一。Survivin基因是1997年新近发现的一种凋亡抑制基因，在肿瘤的发生、发展的病理过程中，能抑制肿瘤细胞的凋亡使肿瘤细胞得以生存。它能够广泛表达于人体胚胎组织和多种恶性肿瘤组织，而在正常组织中几乎不表达。尤其是作为一种广谱表达的肿瘤特异性凋亡抑制因子，抑制Survivin的表达将可能成为肿瘤靶基因蛋白治疗的理想靶点。对于Survivin以何种机制抑制凋亡众多研究认为［1］ Survivin可通过直接抑制凋亡信号转导过程中最下游的效应分子Caspase-3的活性而阻断细胞凋亡的发生过程。 近来研究发现，肿瘤是一类细胞增殖周期紊乱性疾病，即细胞凋亡失控的疾病，细胞周期的调控在肿瘤的发生和治疗中起重要作用［2］。在细胞周期的G1期及G2/M期存在检验点调控（checkpoint control），其功能是在细胞进行有丝分裂时控制有丝分裂器的装配，维持细胞倍性，保持细胞分裂的同步，从而保证细胞周期在上游事件正确完成的前提下才启动下游事件［3］。本实验发现，Survivin的表达对促进乳腺癌细胞完成有丝分裂具有重要作用，采用Survivin ASODN转染乳腺癌细胞后，出现了G2/M期阻滞现象，表现为转染后G2/M期细胞较对照组显著增加，而G1期细胞减少。且随着Survivin ASODN浓度的增加，转染后G2/M期细胞逐步增加而G1期细胞迅速减少。由于Survivin仅特异地表达于细胞周期的G2/M期，因此可以推测Survivin基因对于细胞顺利地通过G2/M期检验点，促进细胞周期从G1期向S期变化，从这个意义上也可以认为Survivin是一种G2/M检验点调控相关基因。封闭Survivin的表达可以诱导乳腺癌细胞的生长停滞于G2/M期，使之无法完成有丝分裂，从而抑制乳腺癌细胞的增殖活性促进其发生凋亡。 细胞周期阻滞以及检验点调控可以通过诱导细胞凋亡来清除损伤的细胞，阻断细胞增殖周期进程可以引起凋亡，细胞增殖周期与凋亡密切相关，而凋亡也常伴有细胞生长阻滞［4］。研究发现，Survivin主要定位于有丝分裂末期的中体，Survivin表达的下调使细胞纺锤体能够延长，但不能完成有丝分裂，从而导致多核细胞的蓄积，其功能类似于C.elegan的BIR-1蛋白［5］。本实验发现经Survivin ASODN转染后阻断乳腺癌MCF-7细胞Survivin的表达可以导致MCF-7细胞阻滞于G2/M期并发生凋亡，提示Survivin在肿瘤细胞分裂的调控中发挥了重要作用，这一结果与Survivin特异性地表达于细胞周期的G2/M期以及其在纺锤体的定位等特性也是一致的。因此可以认为Survivin ASODN转染后乳腺癌细胞发生G2/M期阻滞除了可以阻止乳腺癌细胞完成有丝分裂，抑制其增殖活性以外，更重要的是可以通过阻断细胞周期的进程诱导乳腺癌细胞发生凋亡。Survivin在G2/M期的选择性表达决定了其表达被ASODN封闭后细胞发生在G2/M期阻滞并发生凋亡。 本实验通过DNA电泳发现Survivin ASODN/Lip在400ng/ml作用48h后可检测出特异性凋亡带，终浓度为600ng/ml，800ng/ml时较明显。凋亡细胞的生化改变关键点是DNA链被核酸内切酶从核小体处切断形成大约180~200bp整数倍的DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测，表现为DNA梯形构型或条纹，说明ASODN在Lip倡导下能诱导MCF-7细胞发生凋亡。利用流式细胞仪测量DNA含量时即可辨别凋亡细胞，其特点是在正常细胞周期前出现一个不连续性亚二倍体峰（或凋亡峰），凋亡峰的出现及其大小是流式细胞仪定量分析DNA断裂的一个重要指标，较琼脂糖凝胶电泳检测具有更高的灵敏性且能精确定量区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞与死亡细胞。本实验通过流式细胞仪检测不同浓度ASODN/Lip转染组凋亡峰值较Lip、NODN/Lip组明显上升（P<0.05）。实验发现经600ng/ml Survivin ASODN/Lip处理后的MCF-7细胞经Hoechst 33258/PI双重染色后，在荧光显微镜下经紫外光激发可观察到细胞肿胀、体积增大、外形不规则、细胞膜皱缩、染色质浓缩边聚呈新月形、细胞核固缩与断裂、核仁消失等细胞形态学改变，在细胞核或细胞质内可见到有浓染致密的颗粒状荧光的早期凋亡细胞及被染成红色荧光的坏死细胞。通过电镜下观察Survivin ASODN/Lip在400ng/ml作用48h后发现大量的凋亡细胞，表现为MCF-7细胞出现较多的致密的凋亡小体，并出现细胞核浓缩、核聚集、核碎裂、核边聚集等。在ASODN/Lip 600ng/ml及800ng/ml组则可观察到更多的细胞凋亡形态学改变，而在Lip组及NODN/Lip组细胞超微结构未发现明显的凋亡细胞形态学改变。肿瘤的反义基因治疗是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以阻断瘤细胞内的异常信号传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡的一种治疗手段。因此反义寡核苷酸封闭凋亡抑制基因Survivin可能成为一种有效的治疗肿瘤的措施，为今后乳腺癌的综合治疗以及联合其他基因的治疗提供了一种有效的途径。【参考文献】 1 Oconnor DS， Schechner JS， Adida C. Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial cell. Am J Pathol，2000，56：393-398. 2 Hartwell LH， Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science，1994，266(5192)：1821-1828. 3 Hartwell LH， Weinert TA. Checkpoints control that ensure the order of cell cycle events. Science，1989，246(4930)： 629-634. 4 Chiarugi M，Magnelli L， Cinelli M， et al. Apoptosis and the cell cycle. Cellular Mol Biol Res，1994，40(7-8)： 603-612. 5 Chen J， Wu W， Tahir SK， et al. Down-regulation of survivin by antisense nliunnucleotides increases anontosis inhibits cytokinesis and anchorage-independent growth. Neoplasia，2000，2(3)： 235-241. 上一页 [1] [2]
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