朱绍辉（莱阳农学院动物科技学院2000级动物科学专业）
21世纪是生物世纪。基因治疗的兴起和人类基因组计划的全面实施已有力地说明了这一点。著名遗传学家谈家桢教授高瞻远瞩地指出：“21世纪的医疗革命将取决于基因治疗
研究的成功。”
1 概念
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，目前开展的基因治疗只限于体细胞。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。
广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗，而通常说的狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，一般用DNA序列，主要的治疗途径是体外（ex vivo）基因治疗，即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内，最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物。除间接体内法外，还可以用基因药物进行直接体内途径治疗，这些基因药物可以是完整基因，也可以是基因片段（包括DNA或RNA）；可以是替代治疗，也可以是抑制性治疗（包括DNA转录水平和mRNA翻译水平）。基因药物不但可用于治疗疾病，而且可用于预防疾病。这类基因药物治法简单易行，
发展迅速，新型基因药物不断产生。从1990年转移ADA基因到现在的大部分基因治疗临床试验都是体外基因治疗，先从病人体内获得某种细胞（例如T淋巴细胞），进行培养，在体外完成基因转移后，筛选成功转移的细胞扩增培养，然后重新输入患者体内。这种方法虽然操作复杂，但效果较为可靠，称其为。同时，科学家们又千方百计设计出更加简便的基因治疗方法。例如，1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr 转入患者肺组织中。这种直接往人体组织细胞中转移基因的治病方法叫做体内（in vivo）基因治疗。
外源基因只有整合到染色体中，变为其中一部分才有可能得到持续的高表达。因此，采用什么样的手段将精心挑选的功能基因送到体内，穿过细胞膜，进入细胞核与染色体整合，这是基因治疗成败的关键。无论是体内（in vivo） 还是体外（ex vivo）基因转移都需要一种安全、无毒的工具来携带外源基因进入细胞内，这种工具被称作载体（vector）。科学家们发现，病毒侵染人体细胞时能将自身的基因组携带到细胞内，并利用人体细胞内物质完成自身繁殖，最终导致人类疾病。利用这一特性，科学家将病毒基因组中与致病相关的基因去掉，保留其携带基因组进入人体细胞的功能，再组装上理想的外源基因，即成为一种病毒载体。这样经过遗传修饰的病毒载体不能在人体细胞内复制，更不会致病，只可能将外源治病基因带入人体细胞内。目前，世界各国对病毒载体的
研究较广泛，绝大多数临床试验都运用了这种方法。
2 基因治疗的方法
（一）．基因转移方法
（1）特异正常基因的分离与克隆：应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位
研究成果，已有不少基因并将会有更多人类基因被分离和克隆，这是基因治疗的前提，在当代分子生物技术条件下，一般来说，只要有基因探针和准确的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，现在既可人工合成DNA探针，还可用DNA合成仪在体外人工合成基因，这些都是在基因治疗前，分离克隆特异基因的有利条件。
（2）外源基因的转移：基因转移（gene transfer）是将外源基因导入细胞内，其转移方法较多，常用的要有下列几类：
1）化学法：将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和磷酸钙、DEAE－葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倾入培养基中与细胞接触，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些化合物可扰乱细胞膜，故可将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下，整合基因得以表达，细胞亦可传代。这种方法简单，但效率极低，一般1000－100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。要达到治疗目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。当然，可以通过选择培养的方法来提高转化率。
2）物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法。
①电穿孔法：电穿孔法（electroporotion）是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。
②显微注射法：显微注射（microinjection）是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。此法用于生殖细胞时，有效率可达10％。直接用于体细胞却很困难。在动物实验中，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达而传代，这样的动物就称为转基因动物，目前成功使用得较多的是转基因小鼠（transgenic mice），它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。
③脂质体法：脂质体（liposome）法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。
3）同源重组法：同源重组（homologous recombination）是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁组装一Neo基因，则在同源重组后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin）的培养基中生长，从而使未插入新基因片段的细胞死亡。对于体细胞基因治疗，体外培养细胞的时间不能过长，筛选量大，故在临床上应用也受限制难以进行。今后如能改进技术，提高重组率，这种定点修正基因的方法仍是有前景的。
4）病毒介导基因转移：前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转移（viral mediated gene transfer）是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体（vector）,将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体（viral vector）。目前应用的有两种病毒介导基因转移方法。
①反转录病毒载体：反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。反转录病毒载体有以下的优点首先是具有穿透细胞的能力，可使近100％的受体细胞被感染，转化细胞效率高；其次，它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；再者随机整俣的病毒可长期存留，一般无害于细胞，但也存在缺点：这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此，人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去，仅留它们的外壳蛋白，以保留其穿透细胞的功能，试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒（defective virus）。这样的病毒中的反转录酶可将RNA转化为DNA，有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组，而该病毒则死亡。由于病毒整合基因组是随机的，所以还是可能激活细胞的原癌基因，以及因随机插入发生插入突变。
在反转录病毒载体中，最常用于人类的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV），其人工构建的结构如图14－1。
②DNA病毒介导载体（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒，实用意义不大，但
图14－1 Mo-MLV结构示意图
LTR：长末端重复序列，内含启动子、增强子及有关调节顺序；gag：病毒核心抗原基因；
env：病毒外壳蛋白基因；pol：反转录酶基因
牛乳头瘤病毒重组后，可不插入宿主染色体中引起插入突变，又可在宿主染色体外独立复制，并表达出基因产物。有人发现，因缺少E1区而致复制缺陷的腺病毒，可在表达E1基因的细胞中繁殖。后来证明，载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。它代表了基因治疗的新方向。图14－2是人的外源基因包装在缺陷型反转录病毒中，感染细胞经培养后再输入病人进行治疗的模式图。
图14－2 人的外源基因包装在缺陷型反转录病毒中感染细胞
经培养后再输入病人体内进行治疗模式图
最近，美国设计了一个新的腺病症载体（图14－3），它是用一个化学连接器即赖氨酸链（lysine chain）将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个表面抗体而进入细胞核，使宿主基因与治疗基因共同表达。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体（adeno virus-polylysine DNA-complex）。
图14－3 腺病毒赖氨酸DNA复合体
采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义；②病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低；③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外，并持续表达；④已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性。前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因，而其它病毒只能运输70 00bp的基因。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景。
(二)靶细胞：这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。选择靶细胞的原则是：①必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；②具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期;③易于受外源遗传物质的转化；④在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。许多遗传病与造血细胞有关，故可用于如β地贫、严重复合免疫缺陷病等的基因治疗。皮肤成纤维细胞易于移植和从体内分离，又可在培养中生长，并易存活，故有人用之于乙型血友病的基因治疗。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷，因此，在家族性高胆固醇血症的治疗中，有将低密度脂蛋白（LDL）受体基因转移至肝细胞的尝试。在动物实验中已证明：β－半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因都已
3 基因治疗的现状
基因治疗的结果就象给基因做了一次手术，治病治根，所以，有人又形容其为“分子外科”。我们可以将基因治疗分为性细胞基因治疗（germline gene therapy）和体细胞基因治疗（somatic gene therapy）两种类型。性细胞基因治疗，是在患者的性细胞中进行操作，使其后代从此再也不会得这种遗传疾病。但实际上，目前的技术水平还远远没有达到要求，难以解决关键的基因定点整合（或称基因打靶）问题，加之勇于接受治疗的志愿患者甚少，还不能进入临床试验。体细胞基因治疗,是当前基因治疗
研究的主流。截止1996年6月，世界上接受这一疗法的患者已达1537例，说明体细胞基因治疗的技术路线具有较好的可操作性。但体细胞基因治疗的不足之处也很明显，它并没有改变病人已有单个或多个基因缺陷的遗传背景，以致在其后代的子孙中必然还会有人要患这一疾病。
外源基因只有整合到染色体中，变为其中一部分才有可能得到持续的高表达。因此，采用什么样的手段将精心挑选的功能基因送到体内，穿过细胞膜，进入细胞核与染色体整合，这是基因治疗成败的关键。无论是体内（in vivo） 还是体外（ex vivo）基因转移都需要一种安全、无毒的工具来携带外源基因进入细胞内，这种工具被称作载体（vector）。科学家们发现，病毒侵染人体细胞时能将自身的基因组携带到细胞内，并利用人体细胞内物质完成自身繁殖，最终导致人类疾病。利用这一特性，科学家将病毒基因组中与致病相关的基因去掉，保留其携带基因组进入人体细胞的功能，再组装上理想的外源基因，即成为一种病毒载体。这样经过遗传修饰的病毒载体不能在人体细胞内复制，更不会致病，只可能将外源治病基因带入人体细胞内。目前，世界各国对病毒载体的
研究较广泛，绝大多数临床试验都运用了这种方法。
从1990年转移ADA基因到现在的大部分基因治疗临床试验都是先从病人体内获得某种细胞（例如T淋巴细胞），进行培养，在体外完成基因转移后，筛选成功转移的细胞扩增培养，然后重新输入患者体内。这种方法虽然操作复杂，但效果较为可靠，称其为体外（ex vivo）基因治疗。同时，科学家们又千方百计设计出更加简便的基因治疗方法。例如，1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr 转入患者肺组织中。这种直接往人体组织细胞中转移基因的治病方法叫做体内（in vivo）基因治疗。
4 基因治疗的优越性
基因疫苗被称之为第三代疫苗，自1993年问世后，在短短的5年中
发展迅速。它与传统的疫苗相比，具有以下显著的优越性：
1） 抗原基因在体内持续表达产生抗原，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果更可靠。
2） 对于易变异的病毒，可以选择各亚型共有的核心蛋白保守DNA序列作基因疫苗，产生跨株系的免疫保护反应，从而避免易变异病毒产生的免疫逃避问题。
3） 一个质粒可插入多个抗原基因，即组成多价基因疫苗，故一种基因疫苗可免疫多种疾病。
4） 基因疫苗具有减毒活疫苗的免疫原性，但不会存在活疫苗的毒力回升的危险。
5） 基因疫苗的质粒DNA无免疫原性，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应，故可重复使用。另外，基因还不会受机体已有抗体的影响，可用于带母体抗体的婴儿。
6） 对于毒性大、危险的病毒，以及难以提取抗原的疫苗，基因疫苗的制备相对安全，容易得多。
7） 基因疫苗制备简单，容易大量生产，且成本低。质粒DNA非常稳定，易于贮存和运输。
8） 使用方便，可以经多种途径给药，不需免疫佐剂等。
5 基因治疗的存在的问题基因疫苗作为一类新型疫苗，还有一些方面不完善，在实际应用中还存在一些问题有待解决：
1） 安全性问题：基因疫苗一般不会整合到染色体基因组上，但不能排除少数质粒DNA插入到染色体上，引起插入突变的可能性。不过目前的动物实验尚未发现发生插入突变的证居奇
2） 免疫效率有种属个体差异：各动物之间的免疫效率不一样，这可能与不同动物细胞需要不同启动子有关。同种动物之间也有个体差异，免疫效率往往不能达到百分之百，这可能与抗原基因、给药方法途径、给药量有关。
3） 基因疫苗体内持续表达产生抗原蛋白，可能引发免疫耐受。
4） 基因疫苗的免疫应答机制仍不清楚。
6 基因治疗的安全性
患有罕见的单基因遗传病的Gelsinger是美国首位明确由基因治疗导致丧生的患者。2000年3月7日，为进一步加强临床试验监查力度，FDA和NIH公布了两项新措施：（1）制定了基因治疗临床试验临查计划；（2）定期开办基因治疗安全性专题研讨会。新制定的临床试验临查计划要求临床试验主办单位定期向FDA和NIH递交临床监查报告，并对临床监查员资格、如何加强临床监查作了具体布置；每年举办4次基因治疗安全性专题研讨会，同时，FDA和NIH还将支持各专业机构和学术团体举办有关基因治疗安全问题的各种会议。基因工程技术始于20世纪70年代，一直受到新闻、党派、宗教等社会团体的非议，单就美国国会曾就多次对基因工程技术的安全性和伦理学问题进行过讨论。一些人甚至认为基因治疗应“回到实验室”。事实却是，Gelsinger只是美国参加300多个临床试验共5000多例临床试验者中因基因治疗副反应发生死亡的惟一例子。现在需要做的是呼吁政府尽快完善基因治疗临床试验法则，加大政府的临床监查力度，使基因治疗沿着更为安全的轨道开展
7 基因治疗的前景
基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗。其产品形式是放在某个载体上的基因，通俗地说，就是拿基因当\"药物\"。基因治疗产品使细胞产生内源性的目的蛋白质或多肽，从而发挥特异的生物治疗作用。它使得给药更加特异、高效和安全，更加接近医学科学所期望达到的最高目标。基因治疗是对传统医学治疗的一场革命，将对传统制药业产生深远影响和冲击。
传统的医药工业已经不再适应当今高技术
发展的潮流，这种高成本低产出的工业模式如果不寻求新的突破、寻求新的经济增长点，必然要被历史淘汰。国内外众多大型医药企业已经清醒地认识到这一点，并纷纷投巨资参与基因药物的
研究和产业化。基因治疗专业公司从1995年的十大公司，到1999年的约30家，2002年达300多家。一些大的跨国制药公司纷纷瞄准了这些中、小基因治疗公司，与之形成战略合作，以便争夺未来的新兴市场。另一方面传统制药企业也逐步加强同基因企业之间的联系，开展战略合作。卓有远见的医药企业家正在引导他们的企业进行自我革新，及时地把握住世界医药工业
发展的主方向--基因制药，以便在今后的医药工业竞争中立于不败之地。美国权威机构对其类似产品做出预计，在巨大的医疗需求和治愈重大疾病的潜力的驱动下，世界上第一个基因治疗产品被商业化推出，将迅速推动基因治疗行业形成巨大的市场，成为二十一世纪新的经济增长点。毋用置疑，这种成功将带来巨大的社会效益和经济效益。一幅基因
研究发展图显示，基因治疗是当今基因生物技术的里程碑，是二十一世纪的科学、医药和商业。
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