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[本篇论文由上帝论文网为您收集整理，上帝论文网http://paper.5var.com将为您整理更多优秀的免费论文，谢谢您的支持] 长期以来,世界各国对口蹄疫(ＦＭＤ)防制十分重视,进行了广泛深入的 研究,但近年来,本病在一些国家和地区频繁暴发流行,造成了巨大经济损失。 1 、口蹄疫病毒和口蹄疫 ＦＭＤ是由口蹄疫病毒(ＦＭＤＶ)引起的偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病,被国际兽疫局列为Ａ类动物传染病之首。易感动物包括牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼和猪等20个科的70多种家养和野生哺乳动物。猪和牛的临床表现最严重(也有猪发病而牛不发病),羊只表现亚临床感染。在自然状态下ＦＭＤＶ可经消化道感染,经呼吸道感染是最主要的传播途径,数个感染性病毒颗粒即可引起动物发病。动物、人员及运输工具等均可机械性的散播病毒。感染动物在表现临床症状前24ｈ就开始向外排毒,病毒可随呼出的气体及尿液、鼻液、水疱液及水疱皮等排出而污染环境,感染牛奶中也含有大量病毒。病毒粒子飘浮于空气中,可随风传播到很远的地方,空气的温度、湿度及太阳光照等与病毒的空气传播有很大关系。病毒一般先在咽喉、食道(Ｏ/Ｐ)部上皮产生一级水泡,随后出现病毒血症,扩散到全身组织器官后,病毒优先选择口、蹄等部位定居产生二级水泡。急性期约1周,然后病情逐渐减轻,幼龄动物可因心肌炎而死亡。病毒可在动物的咽、食道部上皮内持续存在很长时间,故检测ＦＭＤ可刮取Ｏ/Ｐ液检查是否有病毒存在,通过这一方法也可检测病毒在某种动物体内持续感染的时间。在反刍动物,可从感染数周至数年的动物咽、食道部分泌物(ＯＰＦ)中分离到病毒,在自然感染和免疫动物均可产生持续性感染[1],这种持续感染的机理还不清楚。Ｄｏｍｉｎｇｏ等提出了口蹄疫持续感染的“准种”理论,认为感染的ＦＭＤＶ是一群在抗原性上和基因组上有不同程度差异的病毒种群组成的,这些异质性的病毒群的传播即使在没有免疫压力的情况下也会导致抗原变异株的产生,抗原变异株病毒可选择性的适应于宿主的咽、食道部上皮而造成持续感染[2,3]。带毒动物一旦接触易感畜群,则很有可能导致本病暴发流行。这方面的 研究正在深入进行。 ＦＭＤＶ属小ＲＮＡ病毒科口蹄疫病毒属成员,其所在的小ＲＮＡ病毒科在医学和兽医学上具有重要地位,该科包含许多重要的人和动物病毒,如人的脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒、柯萨奇病毒、脑 心肌炎病毒、鼻病毒等;重要的动物病毒还有猪水疱病病毒、肠道病毒。最近将Ａ型马鼻炎病毒也列入口蹄疫病毒属,其基因组结构与ＦＭＤＶ非常相似。通过交叉保护试验和血清学试验确定ＦＭＤＶ有7个血清型,即Ｏ、Ａ、Ｃ、ＡｓｉａⅠ和ＳＡＴ1、ＳＡＴ2、ＳＡＴ3,及65个以上的血清亚型。根据7个血清型的同源性将其分为两群,即Ｏ、Ａ、Ｃ和ＡｓｉａⅠ型为一群,ＳＡＴ1、ＳＡＴ2、ＳＡＴ3为一群,两群之间的血清型同源性仅为25%～40%,群内同源性可达60%～70%,血清型之间无交叉和交叉免疫现象。Ｏ、Ａ、Ｃ型ＦＭＤＶ的毒力和抗原性均易发生变异,几乎遍布亚、非、拉、欧各洲;ＳＡＴ1、ＳＡＴ2、ＳＡＴ3主要分布在非洲,ＡｓｉａⅠ型主要分布在亚洲。北美洲、中美洲、加勒比海地区及大洋洲为ＦＭＤＶ的清净区[4]。 控制ＦＭＤ一直是各国政府关注的焦点,世界动物及畜产品市场也因此而被划分为两个部分,即无ＦＭＤ国家和有ＦＭＤ国家。无ＦＭＤ国家在家畜和动物源性食品出口方面具有绝对的优势,如澳大利亚、新西兰、加拿大等国,其动物产品在国际市场上不仅受欢迎而且价格不菲。阿根廷、巴西在南美洲口蹄疫消灭计划的支持下,ＦＭＤ的控制和消灭取得了很大的成果,阿根廷曾一度宣布对其家畜不再注射ＦＭＤＶ疫苗。但2001年ＦＭＤ在阿根廷和英国等地重新暴发,进而说明控制ＦＭＤ的复杂性,因而需要对本病的流行机理进行更加深入的 研究。 ＦＭＤＶ为单股正链ＲＮＡ病毒,基因组全长约8500个核苷酸(ｎｔ),由5′ 端非编码区(5′ ＮＣＲ)、一个开放阅读框(ＯＲＦ)和3′ ＮＣＲ组成。5′ ＮＣＲ和3′ ＮＣＲ均具有复杂的二级结构,与病毒复制和基因表达有关的顺式作用元件均位于ＮＣＲ区。5′ ＮＣＲ长约1200ｎｔ,其5′端ｐＵｐＵ结构共价结合有一个ＶＰｇ蛋白(3Ｂ),不同的病毒具有3种不同的ＶＰｇ蛋白。距5′端约400ｎｔ处有一段ｐｏｌｙ(Ｃ)序列,在小ＲＮＡ病毒科中仅ＦＭＤＶ和脑 心肌炎病毒具有ｐｏｌｙ(Ｃ)。对ｐｏｌｙ(Ｃ)上游序列知之甚少,一般认为其5′端呈三叶草结构,ｐｏｌｙ(Ｃ)的长短因毒株不同而有很大的差异,可能与病毒的毒力有关[5]。许多毒株的ｐｏｌｙ(Ｃ)下游有一些假结结构,其功能尚不清楚。 在ＯＲＦ5′端有两个间隔84ｎｔ的功能性启始密码子,是ＦＭＤＶ翻译启始的位点。在第1个ＡＵＧ上游465ｎｔ处具有供核糖体进入识别的内部核糖体进入位点(ＩＲＥＳ),小ＲＮＡ病毒科病毒以一种非帽(ｃａｐ)依赖性的翻译启始机制开始蛋白质的合成,这一点不同于其他ＲＮＡ病毒和真核细胞ＲＮＡ[6]。ＩＲＥＳ序列有一些特殊的结构元件,包含若干非启始ＡＵＧ密码子,一些宿主细胞内的蛋白分子(ｅＩＦ 4Ｂ)可以结合到该部位,启动病毒ＲＮＡ和蛋白质的合成,在某些毒株该片段决定了病毒的表型和神经毒力[7]。 3ＮＣＲ长约90ｎｔ,含有与负链ＲＮＡ合成有关的顺式作用元件,一些ＲＮＡ转录物可以互补结合该位置,暂时性的抑制病毒的感染性[8],3′ ＮＣＲ的删除或替换会降低或消除病毒的感染性和复制能力。3′末端为一约100ｎｔ的ｐｏｌｙ(Ａ)尾巴,ｐｌｏｙ(Ａ)尾与病毒的感染性有关,ｐｏｌｙ(Ａ)越长感染性越强。通过构建感染性的全长ｃＤＮＡ就可以此为工具 研究ＦＭＤＶ不同基因或功能区在病毒增殖和感染过程中的作用[9]。 病毒ＯＲＦ编码一个大的聚蛋白,该聚蛋白在翻译过程中被不断裂解产生病毒的结构蛋白和功能蛋白,实际上并不存在一个完整的聚蛋白。ＯＲＦ可分为Ｌ、Ｐ1、Ｐ2、Ｐ3四个区。Ｌ区编码Ｌｂ和Ｌａｂ两种重叠的非结构蛋白,这两种蛋白是从2个不同的功能性启始密码子启始翻译形成的;Ｌｂ和Ｌａｂ催化自身从聚蛋白上裂解下来,并裂解宿主细胞ｅＩＦ 4Ｆ和ｅＩＦ 4Ｇ,而阻止宿主细胞蛋白合成,脊髓灰质炎病毒2Ａ和ＦＭＤＶＬ蛋白均具有裂解ｅＩＦ 4Ｇ的作用,但裂解的机制不同[10]。ｅＩＦ 4Ｆ是ｃａｐ结合蛋白复合体中的成分,是宿主细胞蛋白质翻译过程中所必需的启始因子[11]。Ｌ区为病毒复制的非必需区,缺失Ｌ区的突变株仍能在宿主细胞内复制[12]。Ｐ1区依次编码ＶＰ4(1Ａ)、ＶＰ2(1Ｂ)、ＶＰ3(1Ｃ)和ＶＰ1(1Ｄ)4种结构蛋白,最后组装成病毒的衣壳蛋白。 Ｐ2区依次编码2Ａ、2Ｂ、2Ｃ3种非结构蛋白,2Ａ为一16个氨基酸残基组成的多肽,能够自我催化Ｐ1 2Ａ同2Ｃ解离,因而认为2Ａ是一个顺式裂解元件,可以利用2Ａ基因同时表达几种病毒的主要抗原基因,制备多价疫苗或诊断试剂[13]。从氨基酸序列分析2Ａ可能是一种Ｔｙｒ Ｇｌｙ特异性的蛋白酶。2Ｂ和2Ｃ的功能尚不清楚。脊髓灰质炎病毒2Ｂ和2Ｃ与病毒ＲＮＡ的合成有关[14],2Ｃ可能与ＲＮＡ的复制有关,2Ｂ与病毒的感染谱有关;2Ｃ和其前体2ＢＣ联合诱导细胞膜上囊突形成,为病毒ＲＮＡ的合成创造条件。甲型肝炎病毒已证实Ｐ2区与病毒的毒力有关。Ｐ3区编码4种非结构蛋白3Ａ、3Ｂ、3Ｃ和3Ｄ。3Ａ被认为是小ＲＮＡ病毒复制复合体与膜结构结合的锚定蛋白,与病毒诱导的细胞病理效应和阻断细胞内蛋白的分泌有关。3Ａ似乎与ＦＭＤＶ的致病性有密切的关系,不同血清型ＦＭＤＶ3Ａ编码区的改变或缺失均会减弱其对牛的致病力[15]。3Ｂ蛋白是由编码区3个串联重复的非等同的基因编码的,因而可以产生3种不同的3Ｂ蛋白(ＶＰｇ),这是ＲＮＡ病毒中少有的信息丰余的例子[16]。ＶＰｇ基因的拷贝数与ＲＮＡ病毒的感染力有关[17]。携带有ｐＵｐＵ结构的ＶＰｇ蛋白可以与3′端的ｐｏｌｙ(Ａ)结合作为病毒ＲＮＡ合成时的引物蛋白,这种特殊的ＲＮＡ复制方式与宿主ｍＲＮＡ转录不同,因而在宿主ＲＮＡ合成受到抑制时,并不影响病毒ＲＮＡ的合成。脊髓灰质炎病毒3ＡＢ和3Ｄ参与构成复制复合体与5′ ＮＣＲ的三叶草结构结合而启始ＲＮＡ的合成。3Ｃ蛋白为Ｇｌｎ Ｇｌｙ特异的蛋白酶,催化大部分聚蛋白的裂解;3Ｃ也参与组蛋白Ｈ3的裂解,可能对宿主细胞的基因转录有阻抑作用。3Ｄ为ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶,又称病毒感染相关抗原(ＶＩＡＡ) 催化病毒ＲＮＡ的合成。这样病毒ＲＮＡ就以ＶＰｇ为引物,以3Ｄ为ＲＮＡ聚合酶,以3Ａ、2Ｂ、2Ｃ及一些宿主蛋白形成复制复合体,附着于胞质内的膜结构上合成负链ＲＮＡ,再以负链ＲＮＡ为模板合成正链ＲＮＡ,新合成的正链ＲＮＡ包被完整的衣壳即成为一个病毒粒子。 3、病毒的抗原结构 2Ａ和3Ｃ催化结构蛋白前体Ｐ1裂解产生ＶＰ0(ＶＰ4 Ｖ2)、ＶＰ1和ＶＰ3。ＶＰ0、ＶＰ1和ＶＰ3各一分子组装成1个非对称的原体,5个原体形成一个五聚体,12个五聚体包裹新合成的病毒ＲＮＡ形成一个病毒粒子,ＶＰ0自我裂解为ＶＰ2和ＶＰ4,从而完成病毒粒子的成熟包装过程。这样衣壳蛋白就由ＶＰ1、ＶＰ2、ＶＰ3和ＶＰ4各60分子组成,形成二十面体的对称结构,具有2、3、5对称结构。病毒粒子无囊膜包裹。ＶＰ1、ＶＰ2、ＶＰ3位于衣壳的表面,ＶＰ4位于衣壳的内部,ＶＰ4的Ｎ端含有一个十四碳的酸。ＶＰ1、ＶＰ2和ＶＰ3具有相似的结构,均由8个β 桶和2个α 螺旋组成,每个β桶由2个四条链组成的β片层结构组成。与β片层结构相连的环和Ｃ端均位于衣壳的表面,Ｎ端位于衣壳的内侧,这些环形结构和Ｃ末端与ＦＭＤＶ的抗原结构有很大关系[18]。 Ｘ射线晶体衍射证明,ＦＭＤＶ粒子为近球形,衣壳表面相对光滑,无其他小ＲＮＡ病毒具有的沟和谷结构。ＦＭＤＶＶＰ1的Ｇ Ｈ环突出于病毒衣壳的表面,形成了ＦＭＤＶ最显著的一个特征。Ｇ Ｈ环由第140～160位的约20个氨基酸残基组成,在其顶部形成了一个高度保守的Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ(ＲＧＤ)序列,ＲＧＤ两侧的序列则高度可变。在其他小ＲＮＡ病毒,ＲＧＤ序列则位于沟和谷的底部。ＲＧＤ序列是病毒同细胞受体相结合的主要位点,也是中和抗体结合的主要位点。Ｇ Ｈ环可以有不同的空间构象,具有较大的运动性。在Ｏ型病毒环的基部(Ｃｙｓ134)同ＶＰ2(Ｃｙｓ130)形成二硫键,可以维持Ｇ Ｈ环的相对稳定[19]。 近年来用人工合成的多肽和单克隆抗体为工具 研究ＦＭＤＶ的抗原结构取得了很大的进展。在Ｏ型ＦＭＤＶ衣壳表面至少有5个抗原位点[20]。其中Ａ位点在ＶＰ1140～160位氨基酸处的Ｇ Ｈ环是最主要的保护性抗原位点,具有较复杂的空间构象;Ｃ位点在ＶＰ1Ｃ端200～213位氨基酸,Ａ型和Ｃ型病毒Ｃ位点和Ａ位点是相互独立和连续的,而Ｏ型病毒Ａ和Ｃ位点构成一个非连续的形态表位;Ｂ位点是ＶＰ2的βＢ βＣ环;位点Ｄ是非连续的,包括ＶＰ1Ｃ末端193位氨基酸残基,ＶＰ3的Ｂ Ｂ结和ＶＰ2Ｂ Ｃ环,这些位点相互邻近,在靠近3倍对称轴处形成一个非连续的形态位点。另外在ＶＰ4可能具有与细胞免疫有关的抗原位点。 4.1常规疫苗 常规疫苗主要指灭活疫苗,弱毒疫苗因其毒力不稳定已很少应用。常用的灭活剂有甲醛、乙酰乙烯亚胺(ＡＥＩ),二乙烯亚胺(ＢＥＩ),β 丙内酯等。佐剂有氢氧化铝胶、皂素、弗氏不完全佐剂、油包水乳剂等。最近人们用分枝杆菌细胞壁的可溶性部分、合成硫辛酰胺、Ａｖｒｉｄｉｎｅ等作佐剂生产ＦＭＤＶ油佐剂灭活疫苗,可以降低抗原的用量,同时增强ＦＭＤＶ的细胞免疫应答[21]。灭活疫苗以细胞培养的全病毒经提纯灭活后作抗原,因而具有良好的免疫原性,免疫动物后产生良好的体液免疫,并伴随有细胞免疫应答,具有良好的保护作用。灭活疫苗的缺点是热稳定性差,需要低温保存,免疫持续期短,抗病毒谱有限,不能区分注射疫苗动物和自然感染动物,同时存在病毒灭活不彻底而散毒的可能性。 4.2蛋白质和病毒亚单位疫苗 蛋白质亚单位疫苗由于只含有病毒衣壳蛋白,不含有核酸,因而具有很高的安全性。ＦＭＤＶ抗原结构 研究表明,ＶＰ1片段是ＦＭＤＶ的主要抗原位点,能诱导机体产生保护性的中和抗体,并能产生部分的保护作用。因此,分离纯化完全的ＶＰ1片段或其Ｃ端1/2部分就成为人们制备ＦＭＤＶ蛋白质亚单位疫苗的目标。利用基因工程的方法克隆和表达ＦＭＤＶＶＰ1编码基因的报道很多,ＶＰ1和其Ｃ端1/2片段在大肠埃希氏菌中表达,表达产物的免疫原性较低,免疫动物后不足以产生完全的保护力。最近利用转基因植物生产ＦＭＤＶ亚单位疫苗的 研究引起了人们的关注。ＶＰ1在转基因烟草和苜蓿中表达的 研究表明,用烟草和苜蓿的叶提取物或在饲料中拌入新鲜收获的叶片免疫小鼠均可获得对ＦＭＤＶ特异性的免疫保护反应[22]。这一结果支持了通过转基因植物生产口服疫苗的可行性。 病毒的空衣壳蛋白保留有病毒颗粒的大部分抗原特性,因而 研究能够表达ＦＭＤＶ空衣壳的重组载体疫苗,一直是许多学者关注的焦点。Ｐ1编码区基因在大肠埃希氏菌中的表达产物为一融合蛋白,动物免疫后可产生一定的保护力。在杆状病毒中表达的Ｐ1融合蛋白具有线性的和非线性的Ｂ淋巴细胞抗原表位,但是还不能产生病毒的空衣壳蛋白。Ｐ1和3Ｃ蛋白酶基因在痘病毒和杆状病毒等表达系统中的联合表达可产生少量的空衣壳[23,24],还需要进一步改进,以提高空衣壳的形成率,进而提高其免疫效力。 4.3合成肽疫苗 ＦＭＤＶ抗原结构的 研究为合成肽疫苗的研制提供了理论依据早期大多数工作是根据病毒衣壳表面的Ｂ细胞表位来设计合成肽疫苗。ＶＰ1的Ｇ Ｈ环是最主要的Ｂ细胞表位,用来自不同血清型病毒的Ｇ Ｈ环肽段免疫豚鼠后可产生中和抗体,并对猪具有保护作用。ＦＭＤＶ的免疫保护与中和抗体的水平和亲合力有关,要产生高效价的中和抗体,还需要有Ｔ细胞,尤其是ＣＤ4+Ｔ细胞的协同作用。因此,在研制合成肽疫苗时加上适当的Ｔ细胞位点是很重要的,并且Ｔ细胞表位必须能被Ｔ细胞上的ＭＨＣⅡ类抗原所识别。由于ＭＨＣⅡ类抗原的多态性,简单的合成肽疫苗难以产生像完整病毒粒子那样的免疫反应。ＦＭＤＶ合成肽疫苗在牛群的大面积免疫效果检测表明,不同的合成肽疫苗只能产生23%～39%的保护作用,免疫后仍发病的牛中有41%从其咽、食道分泌物中分离出了ＦＭＤＶ的突变株,其在Ｇ Ｈ环处发生了氨基酸的替换[4]。合成肽由于其分子较小,空间构象简单,因而对免疫系统的刺激强度和识别信号不够,不仅难以产生针对高度变异的小ＲＮＡ病毒的保护作用,相反还有利于抗原变异株的选择性适应。有效合成肽疫苗的研制还需对ＦＭＤＶ的免疫机理作深入的 研究。 Ｃｈａｎ等[25]将Ｏ型ＦＭＤＶＶＰ1141～160位氨基酸和ＶＰ1Ｃ端200～213位氨基酸残基连接到猪ＩｇＧ的一条重链恒定区上,合成了一种Ｆ ｓｃＩｇＧ的嵌合体蛋白,在猪和小鼠均可产生很好的免疫保护作用,这一结果代表了病毒抗原连接自体抗体生产ＦＭＤＶ合成肽疫苗的一种新途径。Ｄｉｍａｒｃｈ等合成了Ｏ1Ｋ病毒ＶＰ1141～158和200～213位氨基酸残基,并将2个片段用 Ｐｒｏ Ｓｅｒ 连接起来形成了一个具有一定立体结构的40肽段,可以大大提高其免疫原性。另外在ＶＰ1140～160肽上加上适宜的Ｔ细胞表位,如卵白蛋白223～339肽段,鲸鱼精肌红蛋白132～148肽段及用软酯酰基衍生物修饰等均可提高合成肽疫苗的保护作用。通过改进合成肽疫苗的Ｂ细胞表位,添加ＦＭＤＶ结构蛋白和非结构蛋白中的Ｔ细胞表位来合成多肽复合体,以模拟与ＦＭＤＶ中和抗体产生有关的形态表位,或者应用尽可能覆盖所有变异株的多肽复合物,称为“混合表位”来免疫动物,或许可以减少变异株的产生,提高合成肽疫苗的免疫效果。 4.3表达病毒蛋白的复制缺陷性活病毒载体疫苗 将ＦＭＤＶ的主要抗原基因插入某种缺陷性病毒的基因组中构建成重组病毒,这种病毒可感染哺乳动物细胞并在细胞内表达ＦＭＤＶ的抗原蛋白,刺激机体产生免疫反应。带有ＦＭＤＶＰ1区基因的重组痘苗病毒免疫试验小鼠后可保护同源病毒的攻击[26],而仅带有Ｐ1基因的重组腺病毒免疫猪后只产生细胞免疫而无体液免疫反应[27]。目前ＦＭＤＶ腺病毒活载体疫苗的 研究已取得了较大的进展,有望在不久用于ＦＭＤＶ防制。将Ｐ1 2Ａ 3Ｃ基因同时插入复制缺陷性腺病毒5型,构建成重组病毒[28],这种重组病毒侵染ＨＥＫ293细胞,可大量增殖表达ＦＭＤＶ的ＶＰ0、ＶＰ1、ＶＰ3结构蛋白并有少量空衣壳产生,免疫猪后可产生较高水平的中和抗体[29],试验猪一次注射1份该疫苗后7、14、42ｄ用同型病毒攻击能够得到完全的保护[30]。许多学者对活载体疫苗寄予了很大的希望,希望通过共表达一些Ｔ细胞位点和细胞因子而使活载体疫苗的免疫效力进一步提高。 4.4ＤＮＡ疫苗 用裸ＤＮＡ免疫动物能够激发体液免疫和细胞免疫反应,并具有很好的保护作用。将缺失Ｌ基因或ＲＧＤ编码基因的全长感染性ｃＤＮＡ克隆免疫猪后可产生保护作用[31]。Ｗｏｎｇ等[32]构建了含有ＦＭＤＶＶＰ1141～160和200～213位氨基酸残基编码区和宿主自身ＩｇＧ编码区基因的表达质粒,用这种质粒ＤＮＡ疫苗分别免疫小鼠和猪,均可产生细胞免疫和体液免疫反应,具有较好的免疫效果。梅岛动物病毒 研究所的科学家们开发了两种不同类型的ＦＭＤＶＤＮＡ疫苗,其中一种ＤＮＡ疫苗含有编码衣壳蛋白Ｐ1和非结构蛋白3Ｃ的基因,通过3Ｃ基因的突变 研究表明,衣壳的组装对产生保护性的中和抗体是必需的;另一种ＤＮＡ疫苗含有整个ＦＭＤＶ的基因组,包括3Ｄ聚合酶基因,但是在细胞受体结合位点有一个突变,从而保证重组ＤＮＡ免疫动物后,可以复制产生完整的病毒粒子,但不能致病,这种ＤＮＡ疫苗经肌肉、皮内或基因枪注射等方法免疫猪后可获得部分保护。 4.5基因工程致弱的疫苗 传统的弱毒疫苗由于存在毒力返强已被淘汰。目前通过基因工程的方法,研制缺失ＦＭＤＶＲＧＤ受体结合位点或Ｌ基因的致弱病毒,可诱导宿主产生保护性免疫反应,而不产生临床症状。这种疫苗的稳定性和致病性尚待进一步 研究。 参考文献:
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