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     三江白猪是国家“七五”期间用长白猪和民猪杂交选育成的瘦肉型新品种[1]，主要产于黑龙江省东部地区的国营农场及其附近地区各市、县，是黑龙江东部地区商品猪生产的主要亲本品种。本试验是对三江白猪的基因库、品种优良特性进行的进一步研究。
    1 材料与方法

    1.1 动物及采样 三江白猪样品采自黑龙江八一农垦大学动物科技学院三江白猪原种猪场，东北民猪样品采自黑龙江省兰西县东北民猪原种猪场，长白猪样品采自北京养猪育种中心猪场。随机抽取6个品种猪各20头，分别于前腔静脉采血10ml，加1.75ml ACD(0.48% 柠檬酸、1.32% 柠檬酸钠、1.47%葡萄糖)抗凝[2](因ACD不抑制PCR反应)，充分混匀后分装，待提取DNA。

    1.2 DNA的提取及DNA样品池的制备 向分装的抗凝血中加入等体积的抽提缓冲液(10mml/L，Tis·HCL pH8.0，0.1mol/L EDTA pH8.0，胰RNA酶20μg/ml，0.58%SDS)，

    于37℃水浴1h后，再加入蛋白酶K至终浓度为20μg/ml，置50℃水浴3h。按比例加入酚、氯仿及异戊醇(25:24:1)抽提蛋白，反复抽提5000g离心15min，加乙醇沉淀，加50μl TE(10mmol/L，Tis·HCL pH8.0，0.1mmol/L EDTA)溶解DNA。同一品种20头猪的DNA样品混合，组成DNA样品池，测定其OD值，计算DNA的浓度，放在4℃冰箱内保存备用[2]。

    1.3 引物及试剂 100条RAPD随机引物(10bp)购自鼎国生物公司，Ex.taq酶试剂盒购自大连宝泰克生物公司，琼脂糖为PROMEGA公司的产品。

    1.4 PCR仪 英国HYBAID公司生产HBPX220型。

    1.5 PCR反应 用已筛选出的15条引物对3个样品的DNA进行PCR扩增[3]，25μl的PCR反应体系含10×buffer(含Mg2+)2μl，引物1μl，Taq1.5U，模板20ng，dNTP200μmol/L。扩增程序为94℃加热5min使模板变性，然后进入下列温度循环：94℃变性30s，36.6℃退火40s，72℃延伸2min，进行35个循环，循环结束后在72℃延伸10min[4]。扩增产物用含EB(0.5μg/ml)1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并拍照。引物的编号及序列见表1。

    2 结果与分析

    2.1 三江白猪特异性条带的发现 在本试验对三江白猪及其亲本长白猪与东北民猪基因组的RAPD分析中发现，由引物M-07、A-09、C-11、G-13、I-09可扩增出相应的特异性带，

    此带在三江白猪及其亲本长白猪、东北民猪的RAPD分析中只出现于三江白猪群体内(见图1、2、3、4)。按照相同条件所做的多次重复性试验进一步证明了这些片段的特异性，从而保证所筛选出的三江白猪相对于亲本特异性改变的可靠性。

    2.2 特异性片段的回收与纯化 用冻溶法对特异性条带进行回收[5-6]，特异性条带的大小如图5，由上海博亚生物技术公司进行TA克隆测序，待作进一步的分析。

    3 讨论

    在三江白猪选育过程中，由长白猪与东北民猪杂交，杂种一代与长白猪回交，其后代自群繁殖，后裔择优、性状筛选固定形成三江白猪群。本研究结果表明，根据遗传变异的理论，三江白猪相对于其亲本长白猪、东北民猪基因组已发生了多个位点的变异，利用筛选出的15条随机引物对三江白猪及其亲本长白猪、东北民猪基因组的PCR扩增，从凝胶电泳图可发现，由引物A-09、C-11、G-13、

    G-13、I-09、M-O7、I-09的扩增产物可找出三江白猪的特异性条带。在今后的研究中可以围绕以上几条引物对三江白猪的基因组展开进一步的研究工作，为后续研究工作节约了大量的人力、物力；为三江白猪品种保种计划的制定及品种的进一步的改良、提高奠定了基础；同时我们也希望用以上几条引物的扩增变异情况找到三江白猪的优良性状基因，相对于亲本特异性条带的筛出也为下一步三江白猪本品种自身特异性基因的筛选和研究工作打下了良好的基础，极其利于后续工作的开展；也为三江白猪纯度鉴定工作提供了可靠的理论依据。三江白猪的分子生物学研究工作目前尚属起步阶段，对品种的纯度鉴定也只是依靠动物的外部形态特征，而且这些特征往往会产生错误，可靠性较差。这些特异性条带的获得可为下一步三江白猪品种纯度鉴定及特异性基因的定位、染色体原位杂交的建立等研究提供实验依据和方法。

    [参考文献]

    [1]中国培育猪种编委会编写.中国培育猪种[M].成都：四川科技出版社,1992,85～95.

    [2]J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis. A Laboratory Manual [M](US).Clod spring Harbor Laboratory Press, 1989,486～487.

    [3]赵春霞、杨焕民、李鹏.三江白猪组织DNA提取及RAPD反应条件的优化.[J]动物科学与动物医学,2004,(3):54～56.

    [4]赵春霞、杨焕民、李鹏.三江白猪与其他五个品种猪RAPD分析引物的筛选.[J]黑龙江畜牧兽医,2004(1):15～17.

    [5]Calvo JH,zaragoza P,Osta R.Random amplified polymorphic DNA fingerprints for identification of special in poultry pate [J].poultry science 2001 Apr,80(4):522～524.

    [6]Swine Breeding in China editorial committee.Swine Breeding In China [M].Sichuang Publishing Hovse of Science and technology,1992,85～95.