分析用SPSS13.0统计软件，数据以均数±标准差表示，两样本均数的比较用t检验。多个样本均数的比较，方差齐用q检验法，方差不齐用秩和检验；率的比较用确切概率法；相互依存关系的检验用方差分析F检验。

　　3  结果

　　3.1  肿瘤组织病理学观察各组裸鼠解剖时均未见胸水、腹水；联合组瘤体最小，易剥离，血供较差，切面灰白，并有液化坏死区域。显微镜下见对照组癌细胞生长旺盛，形成癌巢，细胞形态不规则，大小不等，核大呈圆形或卵圆形，核膜增厚，核分裂相较多。药物作用后联合用药D组癌细胞呈大片坏死，结构不清，大部分癌细胞崩解，偶见残余的癌细胞，间质纤维化，角质物质增多癌组织发生退行性变化，高剂量A组、低剂量B组及常规治疗C组癌细胞变性坏死，偶见核分裂相，部分癌细胞核固缩，肿瘤退行性变较对照E组明显。各组HE染色见图1。

　　3.2  裸鼠肿瘤组织hTERT蛋白表达hTERT蛋白阳性表达大部分在胞浆，少部分在胞核，（见图2）。染色综合得分比较（见表1）。各用药组与对照组比较，有统计学差异（P <0.05）；用药组间两两比较，有统计学差异（P <0.05）。表1  裸鼠肿瘤组织hTERT蛋白免疫组化染色综合得分（略）

　　3.3  裸鼠肿瘤组织Bcl-2蛋白表达Bcl-2蛋白阳性表达在胞浆，（见图3）。染色综合得分比较（见表2）。各用药组与对照组比较，有统计学差异（P <0.05）；用药组间两两比较，有统计学差异（P <0.05）。表2  裸鼠肿瘤组织Bcl-2蛋白免疫组化染色综合得分（略）   

　　3.4  裸鼠肿瘤组织Bax蛋白表达Bax蛋白阳性表达在胞浆，（见图4）。染色综合得分比较（见表3）。各用药组综合得分高于对照组，有统计学差异（P <0.05）；用药组间两两比较，有统计学差异（P <0.05）。表3  裸鼠肿瘤组织Bax蛋白免疫组化染色综合得分（略）

　　3.5  裸鼠肿瘤组织凋亡指数的变化表达凋亡细胞核固缩呈圆形或椭圆形、蓝黑色，染色体沿核膜形成半月状或新月状。部分核凝固成致密小圆球形，（见图5）。凋亡指数的变化（见表4），其直方图，（见图6）。各用药组与对照组比较，有统计学差异（P <0.05），A组与B组、A组与C组、B组与D组、C组与D组相比，有统计学差异（P <0.01）。
    
　　凋亡指数：联合用药D组>高剂量A组>顺铂常规化疗C组>低剂量B组>对照E组。

　　3.6  裸鼠组织不同组hTERT，BCl-2及Bax染色综合得分比较根据表1～3，将测定各蛋白表达的结果汇总，获得直方图。见图7。表4  裸鼠肿瘤组织凋亡指数表达（略）

　　从图7结果可知，hTERT与Bcl-2表达： 联合用药D组<高剂量A组<顺铂常规化疗C组<低剂量B组<对照E组；Bax表达：联合用药D组>高剂量A组>顺铂常规化疗C组>低剂量B组>对照E组。

　　4  结论

　　细胞凋亡(apoptosis)是细胞在一定生理或病理条件下，遵循自身的程序，自我结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、多基因控制的、一系列酶参与的过程，BCl-2，Bax是与凋亡最相关的调控基因。

　　Bcl-2最初是从人的滤泡性B细胞淋巴瘤中分离出来的，它定位于人第18号染色体，在淋巴瘤中极易发生染色体易位t（14；18），使Bcl-2与14号染色体上IgH基因并列导致过度表达，是至今为止研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。Bcl-2基因表达产物是一种细胞内膜蛋白，主要位于线粒体内膜、内质网和核膜［3］。通过抵抗多种形式的细胞死亡，延长细胞寿命，使细胞数目累积增多而促进肿瘤的形成。本实验结果显示，裸鼠肿瘤组织空白对照组Bcl-2染色综合得分最高，随着汉黄芩素和顺铂作用后抑瘤率的增强，Bcl-2染色综合得分下降，表明Bcl-2与肿瘤形成有关。Bcl-2的抗凋亡机制有以下几种可能：①Bcl-2具有膜转运功能，能抑制细胞内质网Ca2+的释放，而细胞凋亡中DNA消化需要Ca2+依赖性核酸内切酶参与，推测Bcl-2可通过改变细胞器的Ca2+来抑制凋亡［4］。②Bcl-2能够抑制线粒体膜通透性转运孔开放和维持线粒体跨膜电位，进而阻止线粒体内细胞色素C和凋亡诱导因子的释放，从而抑制凋亡［5］；③Bcl-2通过其BH4结构与Ced-4/Apaf-1结合，扣押Apaf-1/capase-9复合物或抑制其形成，进而抑制凋亡［6］。本实验发现裸鼠组织经药物作用后，随着药物抑制肿瘤作用的提高，Bcl-2蛋白表达逐渐下调，与凋亡指数变化的表达呈相反变化趋势，可能与汉黄芩素抑制Bcl-2基因表达有关。

　　Bax是1993年克隆成功的一种基因，其翻译产物与Bcl-2蛋白大约有21%的氨基酸序列同源，也被称为Bcl-2家族成员之一，其作用与Bcl-2相反，能促进细胞凋亡［7］。Bax蛋白广泛分布于人体许多细胞和组织中，而在多数肿瘤组织及细胞系中表达下降［8］，在肿瘤形成过程，Bax大量激活或表达，通过促进细胞凋亡，抑制肿瘤形成。有研究发现转染Bax基因不仅可使多种细胞发生凋亡，而且可使放射线和化疗药物等许多因素诱导细胞凋亡［9］。本实验发现，随着药物抑制肿瘤作用的增强，Bax蛋白染色综合得分增加了，裸鼠组织Bax蛋白表达与凋亡指数变化的表达呈同向变化趋势，可能与汉黄芩素促进Bax基因表达，从而诱导了细胞凋亡有关。

　　肿瘤的发生，一方面源于肿瘤细胞过度增殖，另一方面与细胞凋亡相对不足有关。端粒酶与凋亡的关系引起了人们极大的兴趣［10］。Fu等［11］通过对嗜铬细胞瘤细胞PC12中的观察发现端粒酶活性随Bcl-2表达增强而升高，Bcl-2的抑制剂可使端粒酶活性迅速下降。张百红［12］等研究证明苦参碱能显著抑制SGC-7901胃癌细胞的Bcl-2的表达；凋亡抑制基因Bcl-2能够调节端粒酶的活性，当Bcl-2过量表达时，端粒酶活性增强；当Bcl-2表达量下降后，端粒酶活性也下降。Mahitosh等［13］研究表明，抗凋亡基因Bcl-2过度表达和凋亡基因Bax表达下降可导致端粒酶活性显著增加。本实验也发现，经汉黄芩素作用后随着浓度增加，抑瘤率的提高，凋亡现象逐渐明显，端粒酶hTERT蛋白、Bax蛋白表达逐渐下调，而Bcl-2蛋白表达逐渐增强。端粒酶活性、hTERT蛋白的下调伴随Bax蛋白表达的增强、Bcl-2蛋白表达的减弱，说明端粒酶与凋亡密切相关。无限增殖是肿瘤细胞的生物学特征，增殖失控关键在于端粒酶的激活；同样凋亡调控功能失调也与肿瘤的形成有关，可以推测凋亡相关基因Bcl-2，Bax直接或间接参与端粒酶活性的调控。下调端粒酶活性，同时也伴随细胞的凋亡，可能是药物对端粒活性的抑制和对端粒结构的破坏，启动了凋亡基因。然而端粒酶的活性调节是一个复杂的系统，汉黄芩素如何抑制端粒酶活性、怎样调节凋亡相关基因如Bcl-2，Bax而发挥作用机制仍不明确，需要我们进一步通过信号传导通路来证实。

【参考文献】
  　　［1］黎丹戎,侯华新,张 玮,等.汉黄芩素诱导卵巢癌A2780细胞凋亡及对细胞端粒酶活性的影响［J］. 癌症, 2003,22（8）：801.

　　［2］Ishimaru K, Nishikawa K, Omoto T, el al. Two flavone 2'-glucosides from sectellaria baicalensis ［J］. Phytoehemistry, 1995, 40(1): 279.

　　［3］Zamzami N,Brenner C,Marzo I,et al.Subcellular and submitochondrial mode of action of Bcl-2-like oncoproteinss［J］.Oncogene,1998,16(17):2265.

　　［4］Lam M,Dubyak G,Chen,et al.Evidence that Bcl-2 represses apoptosis by regulting endoplasmic reticulum-associated Ca2+ fluexes［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(14):6569.

　　［5］Susin SA,Zamzami N, Castedo M,et al.Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease［J］.J Exp Med,1996,184(4):1331.

　　［6］Wang HG and Reed Jc.Mechanisms of Bcl-2 proteins function［J］. Histol Histopathol,1998,13(2):521.

　　［7］Sharma H, Sen S, Mathur M, et al.Combined evaluation of expression of telomerase, survivin, and anti-apoptotic Bcl-2 family members in relation to los

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