，将头部固定于脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱［6］，在前囟前1.6mm至前囟后4.8mm的范围内切取脑组织块，置于相同的固定液后固定3h（4℃），转至30%蔗糖溶液（0.01mol/L PBS配制，pH 7.4，4℃），待组织块下沉后行冠状连续冰冻切片，片厚40μm，隔3取1，收集于0.01mol/L PBS中，待反应。        1.7  免疫组化反应  采用SP法检测SVZ的增殖细胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen，PcomA）的表达，主要步骤如下：切片入3%（V/V）H2O2溶液室温15min，消除内源性过氧化物酶的活性；入0.1%（V/V）Triton X-100溶液（0.01 mol/L PBS配，pH 7.4）室温孵育1h；正常羊血清室温封闭抗原20min；小鼠抗人PcomA单克隆抗体（1:100）室温孵育22h；生物素结合IgG室温孵育2h；SP室温孵育2h；0.05%DAB（含0.01%（V/V）H2O2）室温显色约30s。在上述过程中，完成每一步骤后均用0.01mol/L PBS（pH 7.4）漂洗15min，然后再进行下一步骤。常规脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照实验除用羊血清代一抗外，其余步骤与上述相同。        1.8  细胞计数  每只动物选取3张切片（前囟前0.8mm、1.0mm、1.2mm）作为观察对象［6］，光镜下（40×10）计数左侧侧脑室SVZ的背侧、外侧及内侧3个视野的PcomA阳性细胞数。        1.9  数据统计分析  采用SPSS 10.0统计软件中的单因素方差分析对原始数据进行统计处理，用最小差异显著性检验（LST）及Games-Howell检验对数据进行两两比较，以双侧α=0.05作为显著性检验水准，最后得出的数据以x±s表示。        2  结果        2.1  Morris水迷宫测试结果  各组大鼠的逃避潜伏期及在原平台象限游泳距离的百分比分别见表1及图1。表1  大鼠在水迷宫训练的逃避潜伏期  （s，x±s）注：分别与褪黑素替代治疗组和假手术组比较，*P＜0.01    从表1可见，除测试的第1时段外，去松果体组大鼠在其余测试时段的逃避潜伏期均比褪黑素替代治疗或假手术组大鼠明显延长，组间的差异有非常显著性（P＜0.01），而褪黑素替代治疗组大鼠与假手术组大鼠的逃避潜伏期较为接近，组间差异无显著性（P＞0.05）。在整个测试中，去松果体、褪黑素替代治疗及假手术组大鼠9个时段的平均逃避潜伏期分别为33.89、19.73及18.28s，其中去松果体组的平均逃避潜伏期分别比褪黑素替代治疗组和假手术组明显增加了71.8%和85.4%，组间差异有非常显著性（P＜0.01），但褪黑素替代治疗组与假手术组之间差异仍然无显著性（P＞0.05）。    注：与褪黑素替代治疗组和假手术组比较，*P＜0.01图1  3组大鼠在原平台象限游泳距离的百分比     从图1可见，去松果体、褪黑素替代治疗及假手术组大鼠在原平台象限游泳距离的百分比分别为18.7%、40.3%及45.8%；去松果体组大鼠分别比褪黑素替代治疗组和假手术组大鼠明显下降了53.6%和59.2%，组间差异有非常显著性（P＜0.01），而褪黑素替代治疗组与假手术组大鼠之间差异无显著性（P＞0.05）。        2.2  PcomA阳性细胞的变化  SVZ的PcomA免疫反应产物定位于细胞核，呈棕黄色，阳性细胞核为圆形、椭圆形或梭形，各组大鼠SVZ的PcomA阳性细胞核形态均无明显差异。此外，用羊血清替代—抗的反应结果也为阴性。对各组大鼠左侧侧脑室SVZ的PcomA阳性细胞核计数的结果见表2。表2  大鼠侧脑室SVZ神经干细胞的增殖变化注：与去松果体组比较，*P＜0.01    由表2可见，去松果体组大鼠SVZ的PcomA阳性细胞核数分别比褪黑素替代治疗组及假手术组大鼠明显下降了37.1%和38.8%，组间差异有非常显著性（P＜0.01），而褪黑素替代治疗组与假手术组之间则差异无显著性（P＞0.05）。        3  讨论        神经干细胞是一种具有高度增殖能力的原始细胞，为了解这类细胞的增殖状态，常通过观察其细胞周期中的标志物变化来加以断判之。PcomA既是属于种系发生中高度保守的DNA多聚酶δ辅助蛋白，又是参加细胞DNA合成的一个不可或缺的蛋白因子［7］。PcomA定位于细胞核，在神经干细胞增殖的DNA合成期中表达，且其表达水平与DNA合成的活跃程度呈正比［8］，故PcomA是研究神经发生动力学的一个重要指标。由于PcomA具有以上特点，故本研究用其来观测神经干细胞的增殖变化。        既往研究表明，在体外培养的新生大鼠SVZ神经干细胞经表皮生长因子刺激后，再加入褪黑素可明显提高神经干细胞的增殖率［2］，而且褪黑素还可加速个体胚胎生长和发育的进程［3］，说明褪黑素对细胞发生及胚胎形成均产生明显的正性效应。由此可推测，褪黑素有可能对成年在体SVZ神经干细胞的增殖施加某种影响。为探讨这一问题，笔者最近做了相关研究，结果初步显示，通过切除松果体消除内源性褪黑素的主要来源，可明显降低成年大鼠SVZ的PcomA阳性细胞核数（P＜0.01）［5］；本研究结果则显示，褪黑素替代治疗可使因去松果体下降的PcomA阳性细胞核数明显升高到正常水平（P＜0.01）。因此，以上结果与其他作者的基本一致［2，3］，也充分证实了笔者的推测，即褪黑素对成年在体SVZ神经干细胞具有促增殖作用，而且此作用呈现出对部位、细胞种类及发育阶段的非依赖性。其作用机制可能与两方面有关：（1）褪黑素直接作用于神经干细胞上的相应受体［3］，使PcomA表达上调，促进更多的细胞进入DNA合成期，为产生更多的子细胞提供了合成代谢的物质基础；（2）褪黑素作用于局部星形胶质细胞上的相应受体［9］，促进星形胶质细胞与神经干细胞相互作用并合成及释放多种细胞生长因子，后者可保护子细胞完成迁移抵达终点以及分化成局部中间神经元［10］，这对于完成使局部神经环路的结构得到不断更新转归和整合以及维持功能的可塑性均有重要的生物学意义。        袁群芳等报道［4］，松果体源性褪黑素具有提高大鼠在Morris水迷宫的学习记忆能力。笔者前期的研究［5］、本研究亦表明，去松果体可使大鼠在Morris水迷宫的学习记忆能力下降（P＜0.01），褪黑素替代治疗则可提高去松果体大鼠的学习记忆能力（P＜0.01），这与上述作者的相一致。此外，本实验结果还首次显示，在去松体或褪黑素替代治疗状态下，学习记忆的变化与PcomA阳性细胞核数的变化之间存在着惊人的相似之处，故两者的变化趋势呈现出平行关系。提示褪黑素很有可能通过前述的机制来提高SVZ的神经发生，使神经干细胞产生更多的祖细胞，经吻侧迁移途径（rostral migratory stream）源源不断地迁移到嗅球，最终分化成颗粒细胞和小球周细胞，从而提高嗅觉记忆功能［11］;也有可能通过促进基底前脑胆碱能系统的功能来提高学习记忆能力［4］。至于是否另有提高学习记忆能力的其他机制，有待于进一步研究澄清。        临床研究表明，嗅觉障碍是在老年性痴呆早期首发的主要症状之一，并随病程进展而加重［12］。此外，老年性痴呆患者脑脊液的褪黑素水平显著下降，褪黑素分泌的节律性也明显紊乱［13］。这些结果提示，在老年性痴呆的发病中，有可能由于褪黑素的合成和分泌减退以及节律异常，导致SVZ神经干细胞的增殖严重受损，使嗅球需要更新的局部中间神经元得不到及时补充，进而引发嗅觉及嗅觉记忆功能障碍。因此，除了可用褪黑素调动原位SVZ神经干细胞来防治老年性痴呆外，还可在用神经干细胞移植或基因治疗该病中宜添加褪黑素，使得移植的神细干细胞能有效分裂、整合到靶组织，目的基因也能长期表达产物，从而在该病的神经结构重建及功能恢复方面有可能获得意想不到的效果。【参考文献】    1  Taupin P. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system: functionality and potential clinical interest. Med Sci Monit，2005，11（7）:247-252.    2  段发亮，陈俊抛.褪黑素对EGF作用后神经干细胞增殖的影响.实用医学杂志，2002，18（7）：688-690

上一页  [1] [2] [3]  下一页