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达33D1分子，虽然表达不很高（由于IL-4的加入降低了它们的表达），但仍能证明培养出来的就是DCs。图1 哮喘小鼠骨髓DC培养至第2天的细胞集落图2 哮喘小鼠骨髓DC培养至第4天的细胞集落 图3 哮喘小鼠骨髓DC培养至第7天的细胞表1 哮喘模型鼠与正常对照鼠DC表面共刺激分子表达的百分数 （x±s，%）注：n=3（3复孔的均数），与对照组相比，*P＜0.05图4 流式细胞仪分析图形022、043、027、024为哮喘组DC017、038、037、019为对照组DC 图5 哮喘组和对照组DC表型比较 2.3 两组DC刺激同种异体T细胞增殖能力的分析 结果显示哮喘组DC和对照组DC均能刺激同种异体的T细胞的强烈增殖，且随DC数目的增多而增强；而且哮喘小鼠DC比对照小鼠DC刺激同种异体的T淋巴细胞增殖的能力明显增强，表明哮喘小鼠DC有更强的抗原递呈能力，如表2和图6所示。对同一组小鼠不同DC浓度刺激T淋巴细胞增殖能力比较发现，同在哮喘小鼠中不同DC浓度刺激T细胞增殖的能力也不同，如图7所示。而在对照小鼠中，不同浓度的DC刺激T细胞增殖的能力没有明显差异性（P＞0.05）。表2 哮喘组和对照组DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的比较 （x±s）注：n=3，与对照组相比，☆P＜0.001，△P＜0.01，*P＜0.05 图6 不同DC数目刺激同种异体T细胞增殖的比较 图7 在哮喘组中不同浓度DC刺激T淋巴细胞增殖的比较 注：※P＜0.01，*P＜0.05 3 讨论 DC在体内的含量很少，在血液中仅占单个核细胞总数的0.5%～1.0%，且表面缺乏特征性标志，难以与其他细胞分离纯化，因此，直接从外周血或脾脏中分离不仅操作复杂，而且细胞得率很低，很难满足实验中的大量需要。体外诱导扩增DCs的方法很多。自从Inaba［5］用rmGM-CSF体外诱导扩增小鼠骨髓DC以来，人们逐步建立并完善了多种培养扩增DC的方法。如从脐带血、外周血干细胞、外周血单核细胞中诱导分化出DC。尽管不同的前体细胞扩增DC的方法各不相同，但GM-CSF是必不可少的。GM-CSF可以诱导DC前体增殖分化，并可在体外维持DC的存活。IL-4往往与GM-CSF同时使用，特别是从外周血单核细胞诱导DC时，IL-4可抑制巨噬细胞增生，而有利于向DC分化。但DC的鉴定没有特异的分子标志，若鉴定所得细胞为DC，往往根据形态学、组合型标志和混合淋巴反应刺激同种异体的T细胞增殖这3个方面来判断。除了具有许多树突样的突起这一典型的特征外，其表面还高表达MHCⅡ类分子、共刺激分子和黏附分子如CD40、CD86、CD80、ICAM等；能迁移至引流淋巴结刺激初始T细胞的活化增殖，具有这些特征的细胞方能称之为DC［6］。目前，有一些DC特异的表面标志已经得到公认［7］，如小鼠表面的33D1和NLDC145，大鼠的OX62及人DC表面的CD1a和CD83。本研究获得的细胞在显微镜下呈现大小不一的树突，而且流式细胞分析也检测到了小鼠DC特异的表面标志——33D1和DC相关的分化抗原：CD40、CD80、CD86；最后我们发现所诱导扩增的两组小鼠DC可以强烈刺激同种异体的T淋巴细胞的增殖，并且随着刺激细胞数目的增多而增强。因而，从这3个方面我们可以认定所培养出来的细胞正是DCs。 DC提供了抗原特异T细胞活化、增殖的两个信号。DC在肺表面和气道上皮形成强大的防御网络，可以识别、加工、处理和递呈吸入的抗原，提供抗原信号，形成抗原肽-MHC复合物向引流淋巴结迁移，在迁移过程中，DC表达上调表面共刺激分子CD40、CD86、CD80等，这些分子可以与T细胞表面的CD28结合，形成CD80/CD86-CD28共刺激信号通路，提供了抗原特异的T细胞活化所必需的第二信号，从而启动了初始T细胞的活化。因此认为气道DC在诱导初始型T细胞对吸入抗原的初次免疫反应和过敏反应中起重要作用，是始动气道变态反应之必需［8］。 目前已经知道哮喘的效应细胞是CD4+T细胞，特别是Th2细胞。DC是唯一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，并使其向Th2细胞分化的过程中起重要作用［9］。通过表面共刺激分子的表达来启动Th细胞活化并影响其向Th2细胞的分化和功能。当共刺激信号缺乏时，会导致T细胞反应无能。CD80/CD86-CD28信号通路与过敏性哮喘中的关系已在一些实验中得到证实。研究发现，T细胞表面分子CD80、CD86的配体CD28缺乏时，气道内DC不能诱导Th2反应［10］。阻断CD80/CD86与配体CD28的相互作用，可抑制Th2类细胞因子基因的表达［11］。在小鼠气道炎症模型中减轻小鼠的气道炎症，降低支气管灌洗液中嗜酸粒细胞数量及IL-5、IL-4的含量［12］。在哮喘患者支气管灌洗液中发现，T细胞的活化增殖和IL-5产生依赖于CD86［13］。这些都表明CD86在哮喘发生中的重要作用，依赖于CD86启动初始T细胞的活化，并且诱导Th细胞向Th2细胞分化，促进IL-5的产生，诱发Eos增多的气道炎症。本研究中，哮喘小鼠骨髓DC表达CD86分子水平较对照鼠有明显升高（P＜0.05），进一步证实了DC可以通过其表面的共刺激分子CD86影响Th2细胞分化。CD80主要诱导Th1分化，但对Th2分化也有一定的影响，对抗原所致的炎症有维持和增强作用。Cheng等［11］用OVA致敏BALB/C小鼠建立哮喘模型研究脾脏来源的DC的表型发现，哮喘组CD80的表达明显上调，而CD86则没有差异。但在本实验中却未见CD80在两组小鼠DC中有差异，表明了DC的异质性，不同来源DC可能存在功能上的差异，也提示可能在哮喘的不同阶段，CD86和CD80起着不同的作用。DC表面的CD40可以和T细胞表面的CD40L结合，促进T细胞自身的活化，导致IL-12的产生，而IL-12则可以促进Th1细胞的分化。本研究结果提示，CD40在两组中并未见差异，这值得进一步探讨。 混合淋巴细胞反应即T淋巴细胞的活化增殖反应。这种现象的存在是由于MHC抗原有很强的免疫原性，无论是Ⅰ类还是Ⅱ类抗原，都能在体外直接诱导出强烈的初次T淋巴细胞免疫应答。DC对T淋巴细胞作用的强度与其表面共刺激分子的表达有关。共刺激分子的表达越高，对T细胞的刺激能力越强［14］。本实验结果显示，哮喘小鼠DC和对照组小鼠DC均能诱导同种异体的T淋巴细胞增殖，且随DC数目的增多增殖能力增强。哮喘小鼠DC刺激T细胞增殖明显高于对照组小鼠，表明哮喘小鼠DC的抗原递呈能力明显强于对照组。在哮喘小鼠中随DC数量的增加增殖能力也明显增强，表明DC数量存在差异时，其功能也存在差异，数量多则功能强，数量少则功能弱。 本研究发现，哮喘小鼠骨髓DC表面CD86分子表达增加的同时，其刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力也明显增强，表明了哮喘小鼠DC可能通过其表面刺激分子CD86的差异表达，从而增强了抗原递呈能力，导致了T细胞的过度活化，特别是向Th2细胞的活化，导致气道炎症。但DC在诱导Th细胞分化过程中可能受许多因素的影响，DC诱导哮喘炎症的机制值得进一步研究。【参考文献】 1 Cheng X，Wang C，Qian G，et al. CD80，but not CD86 were upregulated on the spleen-derived dendritic cells from OVAsensitized and challenged BALB/c mice. Immunol Lett，2003，89(1):31-38. 2 Radhakrishnan S，Iijima K，Kobayashi T，et al. Dendritic cells activated by crosslinking B7-DC (PD-L2) block inflammatory airway disease. J Allergy Clin Immunol，2005，116(3):668-674. 3 陈欣，林涛，周童亮，等.雾化吸入白细胞介素-12对小鼠哮喘模型气道炎症和辅助T细胞亚群的影响.中华内科杂志，2002，41:313-316. 4 丁传林，姚堃，张天泰，等.IL-4对DC产生IL-12影响的研究.上海免疫学杂志，2003，23:248-251. 5 Inaba K，Inaba M，Romani N，et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with grannulocyte/macrophage colon 上一页 [1] [2] [3] 下一页
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