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琼脂糖（Promega）。 1.4 特异性引物 CXCR2 5- CTTTTCTACTAGATGCCGC -3，5-AGATGCTGAGACATATGAATTT -3，扩增片段为417bp；β-Actin 5-CAACTCCATCA TGAAGTGGTAAC -3，5-CCACACGGAGTACTTGCGCGCCTC-3扩增片段为180bp，所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.5 方法 1.5.1 表真皮分离 用0.25%分散酶消化分离真表皮，分离后的真表皮分别被置入2个加入Trizol的玻璃研磨器中匀浆备用。 1.5.2 中性粒细胞与单一核细胞的分离 将肝素抗凝静脉血8ml用无钙、镁Hank液对倍稀释，以4∶1的比例向稀释后的血中加入6%葡聚糖，混匀后37℃静置40min，静置后含上述液体的血液混合物分为两层，上层清亮液中含有白细胞。取上层清亮液以3∶2比例沿管壁缓慢加至另一试管中的分层液表面，2000r/min 离心20 min，离心后单一核白细胞位于上层血浆与下层分层液的交界处，中性粒细胞位于管底，分别将单一核白细胞及中性粒细胞移入干燥试管，各用5倍于细胞的Hank液洗2次，在显微镜下记数，取2×106个单一核白细胞及8×106个中性粒细胞加入Trizol备用。 1.5.3 提取RNA 采用Trizol试剂，按说明书操作提取RNA。 1.5.4 反转录合成cDNA 严格按照Invitrogen的试剂盒说明书进行操作。合成cDNA的总体积为20μl。具体如下：10mmol/L dNTP mix 1μl，Oligo（DT）12-181μl，RNA模板8μl，65℃孵育5min，置于冰上至少1min，加入由10×RT 缓冲液2μl，25mmol/L MgCl2 4μl，0.1mmol/L 二硫苏醇糖（DTT） 2μl，RNA酶抑制剂1μl组成的反应混合物9μl，42℃孵育2min，加入逆转录酶1μl，42℃孵育50 min，70℃孵育15min终止反应，置于冰上至少1min，加入RNA酶1μl，37℃孵育20min，去除残余的RNA，获得cDNA。 1.5.5 PCR扩增 反应总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5μl，25mmol/L MgCL2 1.5μl，10 mmol/L dNTP mix 0.5μl，等量上下游引物混合物1μl，相应cDNA 1μl。扩增条件为： 94℃预变性5min。94℃变性33s； 57℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸7min。以β-Actin作为内参照进行半定量。 1.5.6 电泳及照相 用2%琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用0.5×Tris-硼酸，以每厘米胶长5V的电压进行电泳，1h后在紫外发射仪上观察结果并进行近距离摄影。 1.6 图像分析及统计学方法 胶片用薄层扫描仪扫描，所有扩增产物的扫描峰面积值均以相应β-Actin为基准校正后得到扩增产物的相对半定量值。统计学分析采用SPSS 10.0软件包进行处理，采用方差分析法对各组数据进行组间比较。相关性分析采用Pearson模型。 2 结果 治疗前患者的PASI评分为8.4～47.2，平均27.26±8.84；所收集到的治疗后患者的PASI评分治疗前为10.8～43.2，平均25.61±10.78，治疗后为1.2～15.3，平均5.02±3.90，治疗后比治疗前平均下降了80.75%。CXCR2 mRNA的表达情况见表1及图1～4。 表1 银屑病患者中趋化因子受体CXCR 2mRNA表达水平 （x±s） 注：△为银屑病患者皮损部位(治疗前白细胞)/皮损周围(治疗后白细胞)与健康人对照比较；△△为银屑病患者皮损部位(治疗前白细胞)与皮损周围(治疗后白细胞)比较 图1 表皮中CXCR2 mRNA电泳图 图2 真皮中CXCR2 mRNA电泳图 图3 中性粒细胞中CXCR2电泳图 图4 单一核细胞中CXCR2电泳 所测健康对照标本中均存在一定量的CXCR2 mRNA表达。在银屑病患者皮损部位表皮及真皮中，CXCR2 mRNA表达水平均明显高于健康人对照皮肤及同一组患者皮损边缘外观正常皮肤的表皮和真皮，差异均具有非常显著性（P均＜0.001），银屑病皮损周围外观正常皮肤真皮表达CXCR2 mRNA亦高于健康人对照组（P＜0.01）。以PASI-CXCR2进行直线回归分析，结果表皮及真皮中CXCR2 mRNA表达水平与PASI之间均存在明显正相关性，分别为：表皮 r=0.86，P＜0.001；真皮r=0.38，P＜0.05。 在中性粒细胞中，治疗前银屑病患者CXCR2 mRNA表达水平显著高于健康人对照组（P＜0.001），并与PASI评分之间均存在正相关（r=0.84，P＜0.001）；治疗前银屑病患者CXCR2 mRNA表达水平也明显高于治疗后患者（P＜0.01）；治疗后患者与健康人对照组相比较差异无显著性。 在单一核细胞中，治疗前银屑病患者CXCR2 mRNA表达水平明显高于健康人对照组(P＜0.001)，但与PASI之间无明显相关性（ r=－0.122，P＞0.05）。治疗后患者仍高于健康人对照组(P＜0.05)，但同一组患者治疗前后相比较差异无显著性 (P＞0.05)。 银屑病患者皮损部位表皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血中性粒细胞中该受体的表达水平呈正相关（r=0.61，P＜0.001）； 银屑病患者皮损部位真皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血单一核白细胞中的该受体的表达水平呈正相关（r=0.64，P＜0.001）。 3 讨论 趋化因子是主要使细胞发生趋化作用的细胞因子，它们均具有特征性的同源氨基酸序列，几乎所有的趋化因子均含有4个保守的半胱氨酸为其特征，从基因及蛋白质结构上可将趋化因子分成4型，即CXC型（氨基末端的两个半胱氨酸之间被另一氨基酸隔开）、CC型（氨基末端的两个半胱氨酸相毗邻）、C型（氨基末端仅有1个半胱氨酸）及 CX3C型（氨基末端两个半胱氨酸之间有3个氨基酸）。趋化因子通过与其特异性受体结合发挥作用，相应的趋化因子受体也分为CXC、CC、XC及CX3C等4型。在免疫及炎症反应中该系统不仅参与炎症细胞的活化、增殖及向炎症部位的移行，而且通过自分泌及旁分泌途径参与了免疫调节、新血管生成等病理过程，从而对免疫及炎症反应的调节起到重要作用。 表皮中角质形成细胞过度增殖及分化异常是银屑病的基本病理特征。体外研究显示IL-8具有刺激角质形成细胞增生的作用，IL-8需与其特异性受体结合才能活化角质形成细胞并使之发生增殖，CXCR2为IL-8的特异性受体。银屑病患者表皮中存在大量IL-8［1］，培养的银屑病皮损部位角质形成细胞分泌IL-8增加，其上清液对中性粒细胞的趋化作用较健康人的明显增强［2］。笔者用RT-PCR检测发现健康人表皮中存在少量CXCR2 mRNA的表达，提示CXCR2可能参与了正常表皮的增生与分化。Kulke 等［3］的研究结果表明银屑病皮损部位角质形成细胞表达CXCR2增高，作者认为CXCR2可能参与了银屑病表皮角质形成细胞的活化、增生及分化。 皮损部位中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞浸润也是银屑病的基本病理特征。银屑病的主要病理特点之一为皮损部位角质层内白细胞浸润形成Munro微脓肿，这主要是由白细胞自真皮微乳头上端毛细血管向表皮游走所致，这是个十分复杂的过程，涉及诸多细胞因子及免疫分子共同形成的网络，趋化因子及其受体在其中起到了至关重要的作用［4］。IL-8除作为角质形成细胞活化因子外，和GRO-α一道还是组织炎症的介导者，对中性粒细胞及单核细胞具有重要的生物学作用。现认为T细胞依赖性免疫机制在银屑病的发病机制中起着核心作用［5］，但对T细胞在皮损部位聚集的机制仍未完全阐明，多种细胞因子及黏附分子可能参与了T 细胞的调节。IL-8、GRO-α在体外均可趋化T细胞［6，7］，因此推测IL-8、GRO-α和CXCR2相互作用，可能也对T细胞向炎症部位的移行起作用。银屑病皮损部位真皮乳头具有高表达的GRO-α［1］，皮损部位真皮浸润的中性粒细胞表达 CXCR2 mRNA 增高［3］。但Kulke 等［3］发现皮损部位角质层中聚集的中性粒细胞表面测不到CXCR2，提示当中性粒细胞已到达角质层后，CXCR2的表达明显减少，推测可能是因为中性粒细胞在向皮损部位表皮中移行的过程中发挥了功能后产生了某些变化，失去了其原有特征的结果。 本研究结果表明银屑病患者皮损部位表皮和真皮、外周血中性粒细胞及单一核细胞中表达CXCR2 上一页 [1] [2] [3] 下一页
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