果        2.2  登革病毒Taqman MGB PCR体系检测结果        2.2.1  有效性检验  按1.7方法，分别提取登革病毒1～4标准株RNA，进行反转录的实时PCR，1～4型均观察到荧光信号增强。        2.2.2  特异性分析  登革病毒1～4标准株、乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株经TaqmanMGB体系检测，只有登革病毒1～4标准株观察到荧光信号增加外，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株均没有荧光增加信号，见图2。这证明了此TaqmanMGB检测体系的特异性。        2.2.3  登革病毒TaqmanMGB PCR检测体系的应用  用Ⅱ型登革病毒作为阳性对照，对10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG检测为阳性，8份发病10天内疑似乙脑病毒感染病人血清作为对照，其IgM、 IgG检测为阳性。进行TaqmanMGB PCR检测，结果只有5份疑似登革病毒感染病人血清出现荧光信号增加，其他血清标本均无荧光信号。见图3。注：1、2、3、4分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ登        革病毒标准株                   图2  登革病毒荧光PCR特异性分析        注：1：Ⅱ型登革病毒标准株；        2～6：疑似登革病毒感染病人血清标本                图3  血清标本荧光PCR检测结果        3  讨论        Taqman探针是一条与病原体核酸特异性结合的荧光素标记探针，它的结合位点位于普通PCR的2条引物之间［5］。探针的5′端和3′端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团，PCR扩增在加入一对引物的同时加入荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时， Taq酶发挥它的5′→3′的外切酶功能，将探针切成单核苷酸，5′端发出的荧光信号不再被3′端所吸收而能被仪器检测到。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此，随着PCR产物的不断增加，仪器所检测到的荧光信号越来越强。当标本中不含病原体时，PCR反应不发生，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。        TaqmanMGB探针是在Taqman原理基础上提出的［6］。TaqmanMGB探针的突出优点是实验优化、步骤简单，提高了配对与非配对模板间的Tm值差异，由于在探针的3′端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间位置更接近，使杂交的稳定性和重复性大大提高，实验的结果更精确，分辨率更高。        笔者在TaqmanMGB技术基础上，建立了实时PCR检测1～4型登革病毒的方法。上述研究结果表明：（1）本检测方法可靠性好、敏感性高，比普通PCR方法灵敏度提高30%，可检测发病10天内的临床血清标本，而传统的登革病毒分离方法要求发病5天内的标本，才有可能分离出阳性。（2）特异性强，收集荧光在较高的退火温度(60℃)进行，排除了模板的非特异性扩增，同时，与容易造成血清学交叉反应的乙脑病毒及其临床标本都无交叉反应，可用于登革病毒特异性的实时PCR检测。（3）操作简单，结果观察直观明了，采用闭管检测和荧光技术，避免了普通PCR方法容易产生交叉污染而发生非特异性扩增的缺陷，并可防止病毒扩散及环境污染，以及强致癌物溴乙锭对操作人员的危害。（4）快速。传统的登革病毒分离方法耗时较长，至少需半个月，而本方法所需时间仅4h，比传统方法大为缩短，适用于登革病毒的快速准确的检测。【参考文献】    1  肖维威，马文丽，郑文岭.登革病毒的基因组结构及其基因检测.中华检验医学杂志，2003，26(3)：188-189.        2  Jelinek T. Dengue fever in international travelers. Clin Infec Dis，2000，31：144-147.        3  Schwartz E， Mileguir F， Grossman Z，et al. Evaluation of ELISA-based sero-diagnosis of dengue fever in travelers. J Clin Virol，2000，19(3)：169-173.        4  Drosten C， Gottig S， Schilling S， et al. Rapid detection and quantification of RNA of ebola and marburg viruses， lassa virus， crimean-congo hemorrhagic fever virus， rift valley fever virus， dengue virus， and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol，2002，40(7)： 2323-2330.        5  Callahan JD， Wu SJ， Dion-Schultz A， et al. Development and evaluation of serotype-and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. J Clin Microbiol，2001，39(11)： 4119-4124.        6  Zhao JR， Bai YJ， Zhang QH， et al. Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology. World J Gastroenterol，2005， 11(4)：508-510.

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