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动物细胞培养工艺过程监测与控制

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动物细胞培养工艺过程监测与控制

收集整理：佚名来源：本站整理时间：2009-02-06 09:48:45 点击数：[]

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在细胞培养的过程中，随着细胞的增殖、底物的消耗及产物的生成，整个培养系统的状态一直在产生变化。而各种状态变量都有其限制范围，当超出其界限值时就会对培养过程产生消极的影响，降低培养效率。例如培养基的PH值在培养全过程都应控制在6.8-7.4的范围内。因此在动物细胞的培养工艺中，利用过程监测与控制技术使培养系统保持在最佳的状态也是整个工艺中重要的一环。

过程监测是指应用各种检测技术对培养过程中状态变量的变化进行追踪的行为。当这些变量与预测值或与预期变化方式相偏离时，通过过程监测的手段便可以及早发现并开始利用已设定的模型计算如何改变培养状态以及时补偿这种偏离。而过程控制则利用过程监测所提供的信息按照暨定方案进行调整，以使培养过程向更好的方向发展。由于生物培养过程中许多关键变量的值不能够直接在线测得，因此过程监测的基本任务之一就是利用直接测得的变量值去估算间接变量的值，而这也就是状态估计的概念。

1、在线测量

大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，细胞培养环境迅速改变，在线过程监控更为重要。离线取样测定特别是产物浓度测定往往需要一天的时间，因此这种测定结果，不能用来及时指导生物反应器有关参数的控制和细胞培养环境的优化，而且频繁取样容易造成污染，增加费用。因此在线测定生物反应器中培养条件、代谢产物和目的产物浓度等大量数据，并对测定结果进行分析处理，及时对培养系统进行反馈控制是成功进行大规模动物细胞培养的需要^[[i]]。

在培养过程中对于过程监测与控制具有重要意义同时又可在线测量的参数主要包括：温度、PH值、pO₂、搅拌速率、补料速率、罐压以及排出气体中O₂和CO₂的分压，等等。因此，在工业上应用生物反应器进行动物细胞培养时，这些参数都是被在线测量的对象。温度与PH值这两个参数对于细胞而言是最基本的影响因素，而在控制时往往与其它参数相独立。

温度的测量通常在生物反应器内部的单一位置，采用热敏电阻检测器（如Pt100热电阻）进行。PH值则多用复合式玻璃电极测量。Clark复膜氧电极则是溶解氧浓度最常用的检测元件。所有此类检测元件都已成为生物反应器的标准配置。

搅拌转速的检测一般是通过应用磁感应式，光感应式或测速发电机来实现的。磁感应式和光感应式检测器是通过计测脉冲数来测量转速的。安装在搅拌轴或电机轴上的切片切割磁场或光束而产生脉冲电讯号，则脉冲频率就反映了搅拌转速的大小。而测速发电机是安装在搅拌轴或电机轴上的小型发电机，它的输出电压和转速间有良好的线性关系。

补料速率直接影响到培养基中营养物质的浓度，它的值多由输送液体所用泵的单位流量与输送时间来计算，而泵的单位流量需在培养开始前用补料管道进行实际校准。如果不断对补料瓶内的剩余体积进行监测，则可以得到足够精确的补料数据来计算其他参数。

对于通气流量测定有多种不同的方法。根据作用原理，流量计可分成两大类型：体积流量型和质量流量型。体积流量型是根据流体动能的转换以及流体流动类型的改变而设计的测量装置。它会引起流体能量的不同程度的损失，而且测量值受到温度和压力变化的影响。其主要形式有同心孔板压差式流量计和转子流量计。质量流量型是根据流体的固有性质，如质量、导电性、电磁感应性、离子化、热传导性能等进行设计的流量计。如利用热传导性能对空气进行测量时没有能量损失，也不受温度和压力的影响。在对尾气中O₂与CO₂浓度的测量上可以利用质谱仪进行，但实际生产与实验中常利用O₂的顺磁性和CO₂的红外吸收特性进行测定。

2、状态估计

过程变量估计问题大致可以分为两类：状态估计和参数估计，所谓状态变量即是指表示系统动态过程的性态所需的一组最少数目的变量，它是描述过程内在本质的，不一定是物理上可测的变量；而参数一般即指数学模型方程中待定的未知系数。状态和参数的基本区别在于前者随时间变化，而后者随时间保持不变或缓慢变化。

对细胞培养过程所处的状态进行分析时，最直接的方法就是通过在线测量获得数据，再将其代入已有的过程模型中，从而得到关键状态变量（如细胞密度、代谢速率、产物浓度等）的估计值。细胞在培养过程中，对环境的微小变化也是极为敏感的，因此状态估计所用的模型参数也处于不断变化之中。故而状态估计的问题就在于如何从一个运行中的培养系统内不断获得必需状态参数的修正值，从而利用在线测得的直接数据正确地分析培养过程所处的状态。

用于状态估计的技术按照其性质及在实践中的应用可分为许多类型。例如对系统本身及检测数据时产生的随机干扰噪声采用的滤波技术，及针对动态系统特性发展出的“推广卡尔曼滤波”技术；应用非线性动态系统模型以直接检测数据推算不能够直接检测变量的技术；应用状态观测器以动力学模型推测不能够直接检测变量的技术；应用连续参数估算器不断调整过程模型中的参数以适应实际观测数据，从而对状态作出估计的技术等。

3、过程控制的基本类型

控制系统在对培养参数进行调整时可以采用许多模式。总体上可分为开环（open-loop）控制系统与闭环（close-loop）控制系统。

（1）开环控制系统

若系统的控制器与被控对象之间只有顺向作用，没有反向作用，即系统的输出量对控制作用没有影响，则称该系统为开环控制系统。

以细胞培养过程为例，这种控制模式的中心思想是在维持常规参数（温度、搅拌、DO、pH等）稳定的同时，通过已建立的数学模型预测某一时间点细胞的生长代谢状态，估算氨基酸代谢通路和流量以及ATP的消耗，并以此作为培养基补加策略及成分调整的依据，在细胞状态发生改变之前作出调整。在这方面，关于杂交瘤生长和单抗生成的多种数学模型已经建立^[[ii],[iii]]。系统化、结构化的补料策略也有了相当的发展^{[[iv],[v]]。}但由于这种模式要求对细胞生长和代谢的每一个细节都很清楚，在目前对生物体复杂的内在机理认识不足的情况下，理论预测与培养实践仍有很大差距，这使得理论模型应用于实际生产受到了很大限制。

（2）闭环控制系统

系统的输出量或状态变量对控制作用有直接影响的系统称为闭环控制系统。

闭环模式相对于开环模式主要的区别是不需要建立模型去预测细胞和微环境将来的变化,而是通过在线(on-line)和/或离线(off-line)检测手段获得状态数据，由人工或控制软件根据当前值的变化即时调整培养设定参数，使培养系统始终处于最佳状态。这种模式是在细胞状态发生改变之后作出调整，也称为反馈控制模式。细胞培养过程中温度、PH及溶解氧浓度等基本变量的控制都是采用闭环模式进行的。同时由于控制的目的是减小实测值与设定值间的差距，因此属于负反馈控制。

针对动物细胞培养，当前研究的方向有：利用摄氧速率（OUR）与底物消耗速率、副产物生成速率等参数综合估算的结果来反馈调整营养物的流加及培养基的灌流^{[[vi],[vii],[viii],[ix],[x]]}；利用葡萄糖、谷氨酰胺等物质的消耗速率及预先设定的浓度变化点来反馈调整营养物流加速率^[[xi]]；利用培养过程中各种相关物质浓度间的比值设计出“软探针”，并以此反馈控制培养过程^[[xii]]。

（3）PID(proportional integral derivative)控制模型

在培养实践中，一些状态变量如温度，只需要控制在37℃或其他固定的点上就可以满足要求，则其控制采用“三点控制模式”即可。具体控制过程是首先以设定点为基准设置上、下限，当温度高于/低于设定上限时启动/关闭冷却系统，当温度低于/高于设定下限时启动/关闭加热系统，如此使温度保持恒定。但在对更多的状态变量（如PH，补料速率）进行闭环控制时采用这种简单的方法会导致状态变量不断地围绕设定值波动，对细胞的生长与代谢产生不良影响。

在利用闭环模式对培养系统进行控制时，为有效而稳定地减小实测值与设定值间的偏差而免去人为的干预，自动控制理论中一种状态校正模式—PID(proportional integral derivative)控制模式便得到了广泛的应用。它的微分方程表达式为

式中u(t)为输出值或设定值，e(t)为输入值或实测值与设定值间的偏差，而式中的设计参数分别为比例增益K_P、积分增益K_I和微分增益K_D。

利用这种控制模式可以使系统在受干扰而发生波动时尽快进入稳定状态，使细胞所受影响减到最低。

具体的控制过程如图所示，状态变量在PID模式控制下随时间进行而趋于稳定：

设定值

参考文献：

[i]林福玉，陈绍烈，刘红，等.大规模动物细胞培养的问题及对策.生物技术通报，1999，7(1):32-35

[ii] Nielsen L.K.,et al.Avoiding rapid growth at high cell densities:a potentially important optimisation criterion for hybridoma cultures.Cytotechnology,1992,9:21-34.

[iii]胡显文，李佐虎，陈建新，等.气液双升式反应器动物细胞培养及批式生长动力学模型.生物技术通讯，1999,10(2):104-108.

[iv] C.S. Sanderson,et al.A structured, dynamic model for animal cell culture systems. Biochemical Engineering Journal,1999,3:203-211.

[v] Christoph Herwig,et al.On-line stoichiometry and identification of metabolic state under dynamic process conditions.Biotech & Bioeng, 2001, 75(3):345-354.

[vi] Z.Zhou,W.S.Hu.On-line characterization of a hybridoma cell culture process. Biotechnology and Bioengineering, 1994,44:170-177.

[vii] K.Eyer,et al.On-line gas analysis in animal cell cultivation:Ⅱ.Methods for oxygen uptake rate estimation and its application to controlled feeding of glutamine. Biotechnology and Bioengineering,1995,45:54-62.

[viii] Y.S.Kyung,et al.High density culture of mammalian cells with dynamic perfusion based on on-line oxygen uptake measurements.Cytotechnology, 1994, 14:183-190.

[ix] S.S.Ozturk.Engineering challenges in high density bioreactors. Cyto- technology,1996,22:3-21.

[x] R.C.Dorresteijn,et al.On-line estimation of the biomass activity during animal cell cultivation. Biotechnology and Bioengineering,1996,50:204- 216.

[xi] Jason E.Dowd,et al.Glucose-based optimization of CHO-cell perfusion cultures. Biotechnology and Bioengineering,2001,75(2):252-256.

[xii] An-Ping Zeng,et al.Variation of stoichiometeric ratios and their correlation for monitoring and control of animal cell cultures.Biotechnol. Prog.,1998,14:434-441.

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提供人：佚名
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