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β1、CTGF、PAI-1、FN与GAPDH引物由上海生工合成(见表1)。PCR反应体系：5×SYBR Green PCR Buffer 2μl，dNTP 0.5μl，MgCl28μl，AmpliTaq Glod 0.25μl，目的基因上、下游引物各2μl，逆转录产物2μl，总体积25μl。PCR参数：预变性94℃2min；94℃15s、55℃30s、72℃45s，共50个循环。结果以目的基因与内参照GADPH的比值表示，以平衡样本中细胞含量的差异。 表1 PCR引物序列 1.6 统计学方法 所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析和q检验，指标之间的相互关系采用Pearson直线相关回归分析（SPSS 10.0统计分析软件），以P<0.05为差异有显著性标准。 2 结果 2.1 一般情况 实验期间，3只未成模大鼠被剔除；另外，DN组有3只大鼠因高血糖、感染等原因死亡；NC、DL1和DL2组各有2只大鼠死亡，均未记入最后统计。 2.2 体重与血糖 各组糖尿病大鼠的体重均较正常大鼠明显减轻（P<0.01），而各糖尿病组之间差异无显著性（P＞0.05）见表2。血糖变化情况与体重变化情况相似，各组糖尿病大鼠的血糖均较正常大鼠明显升高（P<0.05），而各糖尿病组之间差异并无显著性（P＞0.05），见表3。说明氯沙坦对大鼠的体重和血糖水平均不产生影响。表2 不同时期各组大鼠体重变化的比较 （x±s，g）注：与NC组比较，*P<0.01；与其他组比较，P＞0.05表3 不同时期各组大鼠血糖变化的比较 （x±s，mmol/L）注：与NC组比较，*P<0.01；与其他组比较，P＞0.05 2.3 尿微量白蛋白排泄率（UAER）、肌酐清除率（CCr） 与NC组相比，DN组大鼠UAER于第8周时即显著升高（12.68倍）；第16周时，UAER仍持续上升（21.92倍），比第8周时升高95％。各治疗组与DN组相比，UAER均有不同程度的下降（P<0.05），但仍高于NC组（P<0.05）。DL1和DL2组之间差异无显著性（P＞0.05），见表4。 表4 各组大鼠肾功能变化的比较 （x±s） 注：与其他组比较，▲P<0.05；与DL2组比较，▲▲P＞0.05；与其他组比较，P<0.05；与DL2组比较，P＞0.05；与其他组比较，★P<0.05 DN组大鼠的SCr比NC组明显增高（136％，P<0.05）；各治疗组与DN组相比，SCr均有显著下降（P<0.05），且与NC组大鼠的SCr水平相当（P＞0.05）。同时，DN组大鼠的CCr与NC组相比，已开始下降（14.8％，P<0.05）；各治疗组大鼠的CCr却仍高于NC组（P<0.05）。DL1和DL2组之间差异无显著性（P＞0.05），见表4。 2.4 肾脏组织形态学改变 2.4.1 光镜表现 PAS染色切片高倍镜（×400）下显示，第16周时，DN组大鼠肾小球体积增大，肾小球基膜增厚，肾小球系膜扩张，红染区明显扩大，肾小球毛细血管腔受压变窄。各治疗组大鼠的上述病变均有不同程度的减轻（见图1～4）。 2.4.2 肾脏肥大指数(KW/BW)、肾小球平均体积(MGV)、系膜面积比（FMA）等定量指标 与NC组相比，DN组大鼠KW/BW、MGV、FMA均明显增大（分别为86％、64％、183％）。各治疗组与DN组相比，KW/BW、MGV、FMA均有不同程度的下降（P<0.05），但仍高于NC组（P<0.05）。其中DL1和DL2组之间差异无显著性（P＞0.05），见表5。表5 第16周时各组大鼠肾脏组织形态学变化的比较 （x±s）注：与其他组比较，▲P<0.05；与DL2组比较，★P＞0.05；与其他组比较，P<0.05 2.5 肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1、FN等基因表达情况 与NC组相比，各组糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1和FN的mRNA表达均明显升高（P<0.05）。DN组大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1和FN的mRNA表达升高幅度分别达2292％、1342％、2861％、596％。与DN组相比，各治疗组大鼠肾脏TGF-β1 mRNA表达均有不同程度下调（P<0.05)。其中DL1和DL2组之间差异无显著性(P＞0.05)见表6。说明，无论早期治疗或晚期治疗，氯沙坦均可明显抑制糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1和FN的基因表达，且效果相当。表6 第16周时各组大鼠肾脏TGF-β1、CTGF、PAI-1、FN等mRNA表达比较 （x±s）注：与其他组比较，▲P<0.05；与DL2组比较，★P＞0.05；与其他组比较，P<0.05 3 讨论 3.1 细胞因子在DN发病机制中的作用 本研究显示，第16周时，糖尿病大鼠出现肾脏肥大、肾小球体积增加、基膜增厚、系膜细胞增生和系膜基质扩张等病理改变，同时伴有尿白蛋白排泄率增加、肌酐升高和肾小球滤过率下降，符合临床DN的特征，与Volpini等的研究结果相似［3，4］。 DN的早期病理特征是肾小球肥大、基膜增厚和系膜基质扩张，晚期则表现为肾小球硬化和间质纤维化。细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)进行性积聚是其共同的病理基础。研究表明，在DN亚临床期即可出现系膜扩张，而且其进展与肾脏病变的进展密切相关。本研究结果显示，第16周时，DN组大鼠的FMA比NC组大鼠增加183％，系膜基质面积占肾小球面积的51％；同时CCr下降14.8％。提示由于系膜扩张、系膜与肾小球其他部分的体积比增加，毛细血管腔受压变窄甚至闭塞，滤过面积减少，是导致肾功能进行性减退的主要原因［5］。 合成与降解失衡是造成ECM积聚的主要原因，细胞因子在这一过程中起关键作用［6］。动物研究发现，肾脏TGF-β1在糖尿病肾病的早期和晚期均升高［7］。db/db糖尿病小鼠即使在DN早期，仅有轻度系膜增生而无蛋白尿和间质病变时，其肾小球中的CTGF mRNA增高已达27倍［8］。2002年，Paueksakon等［9］首次证实在DN患者肾组织局部存在PAI-1蛋白表达增多。随后的动物实验研究［10］也证实，STZ诱导大鼠糖尿病后4周、12周和24周时，其肾小球PAI-1 mRNA表达持续增高。我们利用RTPCR检测发现，糖尿病大鼠肾脏TGF、CTGF、PAI-1等细胞因子和ECM成分FN的mRNA表达水平显著升高，与国内外研究结果一致［11］。 TGF-β被认为是肾小球硬化和肾小管间质纤维化发病机制中最关键的细胞因子，在DN相关的生长因子网络中处于中心地位。结缔组织生长因子（conective tissue growth factor，CTGF）则被认为是介导TGF-β促纤维化活性的下游效应因子，在刺激细胞增生和细胞外基质（ECM）合成、促进组织器官纤维化方面起重要作用。而纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor，PAI）在ECM降解酶系统中占据重要地位。糖尿病时，高血糖及其代谢紊乱、血流动力学改变等均可刺激肾脏局部TGFβ、CTGF、PAI-1等细胞因子表达上调，导致ECM合成增多、降解减少，促使ECM在肾脏过度蓄积，促成肾小球硬化、间质纤维化的发生。阻断这些细胞因子的表达与合成，或阻断其受体及受体后效应，将为临床防治DN提供一条安全有效的新途径。 3.2 氯沙坦在DN防治中的作用 RAS激活、AngⅡ增加是DN发病机制中的关键环节。所以，抑制AngⅡ的产生并干扰其作用过程是DN治疗的关键。一些大型临床研究如RENAAL、IRMA及IDNT等验证了ARB在保护DN方面的有益作用。可明显降低糖尿病患者的尿白蛋白排泄率、血肌酐、ESRD和死亡发生率等指标，且这种保护作用独立于其降血压作用之外。 大量动物实验研究［12，13］也证实，在糖尿病模型建立成功之后立即应用氯沙坦治疗，可明显降低糖尿病大鼠的尿白蛋白排泄率、减轻肾小球肥大，对早期DN具有良好的防治作用。本研究发现，氯沙坦可显著降低DN大鼠肾脏TGF-β、CTGF、PAI-1及FN mRNA表达，并能显著减少DN大鼠的24h尿蛋白排泄量、改善肾小球体积增大、系膜基质扩张及其相关的组织病理学异常。但有趣的是，在微量白蛋白尿出现之前或之后应用氯沙坦，对DN的防治作用并没有明显差异（P＞0.05）。提示氯沙坦确实可通过抑制糖尿病大鼠肾脏细胞因子的表达而起到一定的肾脏保护作用；但在相同剂量、相同疗程的情况下，在微量白蛋白尿出现之前进行干预并不比在微量白蛋白尿出现之后进行治疗的效果更好。我们应该积极探 上一页 [1] [2] [3] 下一页
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