胞的作用，见表3、4。AHCSE、5-FU对BEL-7404细胞具有明显的抑制作用，AHCSE为0.5μg/ml，5-FU为1μg/ml时与同时间对照组OD值比较有统计学意义，AHCSE浓度在不小于0.5μg/ml，5-FU不小于1μg/ml时各组与同时间对照组OD值比较差异有非常显著性（P<0.01），当AHCSE浓度≥75μg/ml时抑制作用存在明显的剂量时间依赖关系（P<0.01）。AHCSE对LO2细胞影响很小（P＝1.000），浓度为75μg/mL时才有统计学意义（P=0.049），而5-FU在浓度1μg/ml时，作用48h时对LO2细胞存在抑制作用（P<0.05）。 表1  不同浓度AHCSE作用BEL-7404细胞后不同时间的光吸收值、抑制率  （x±s） 注：与同一时间对照组比较，**P<0.01 表2  不同浓度5-FU作用BEL-7404细胞后不同时间的光吸收值、抑制率  （x±s） 注：与同一时间对照组比较，*P<0.05；与同一时间对照组比较，**P<0.01    2.3  细胞凋亡检测  采用TUNEL法定量检测凋亡细胞，AHCSE、5-FU各剂量组的凋亡情况见表5。        当AHCSE、5-FU剂量为10μg/ml时与对照组比较差异均有统计学意义（P=0.000），剂量为100μg/ml时细胞凋亡率更高；AHCSE、5-FU两剂量组48h细胞凋亡率均较24h明显（P＝0.000）。通过FCM检测，得到AHCSE作用7404细胞48h细胞凋亡率（％，x±s）：对照组为4.15±0.42，AHCSE浓度为5μg/ml时为10.25±0.57，AHCSE浓度为10μg/ml时为16.22±2.77，AHCSE浓度为100μg/ml时为23.21±3.01。浓度为10μg/ml和100μg/ml时与对照组比较P=0.000，浓度为100μg/ml时凋亡率更高。这与TUNEL法检测结果相一致。表3  不同浓度AHCSE作用LO2细胞后不同时间的光吸收值、抑制率  （x±s） 注：与同一时间对照组比较，**P<0.01表4  不同浓度5-FU作用LO2细胞后不同时间的光吸收值、抑制率 注：与同一时间对照组比较，*P<0.05；与同一时间对照组比较，**P<0.01表5  不同浓度AHCSE、5-FU作用7404细胞后不同时间的细胞凋亡率  （x±s，%） 注：与同一时间对照组比较，**P<0.01    3  讨论        蛇毒作为一种天然药用资源，很多组分已被证实对不同肿瘤有一定程度的杀伤作用，但作用成分和作用机制不尽相同［5～7］。我们对AHCSE的体内试验证实其对肿瘤有一定的杀伤作用，作用效果与5-FU相似［1，2］，本实验通过比较AHCSE和5-FU的作用，进一步了解AHCSE的作用效果及其可能作用机制。        本实验选择了BEL-7404细胞、LO2细胞作为实验对象，利用细胞体外培养技术，进行了进一步研究。结果表明：低浓度AHCSE对7404细胞有明显的抑制作用，而对LO2细胞几乎无作用；随AHCSE剂量加大，其对7404细胞的抑制作用虽有所增大，但增加却不甚明显，而逐渐对LO2细胞出现显著的抑制作用。AHCSE对7404细胞的作用与5-FU效果相近，但5-FU在较低剂量就对LO2细胞有较强的抑制作用。AHCSE、5-FU对7404细胞、LO2细胞抑制率与作用时间不相一致可能与药物的半衰期、细胞的生长周期、细胞生长速度有关。大剂量5-FU并不能杀死所有癌细胞，这与5-FU特异性作用于S期细胞有关。这也是临床上控制5-FU剂量、作用时间、为减少毒副作用的原因。中小剂量的AHCSE对7404细胞作用敏感，但对LO2肝细胞影响不大，表明AHCSE的作用安全有效，其浓度约为0.5～50μg/ml，也提示其对正常肝细胞和肝癌可能呈不同生物学行为。有资料显示，蛇毒可能作用于癌细胞表面的特异性受体，这也是蛇毒组分对癌细胞有选择性、副作用小的原因之一［8～9］。        从光镜、电镜结果示悬浮细胞和细胞碎片增多，胞浆内部分线粒体空泡化，成簇，胞膜下多见，胞浆中髓鞘样结构形成等进一步证实AHCSE对肝癌细胞有直接杀伤作用。从TUNEL、FCM检测结果可知：AHCSE能够诱导体外培养的7404细胞凋亡，电镜下未找到典型的凋亡细胞和凋亡小体，可能与送检的细胞数量极大，凋亡细胞相对较少等有关，有文献报道培养细胞在电镜下不易观察到典型的凋亡小体。        肿瘤细胞是一种应凋亡而未正常凋亡的细胞。细胞凋亡是由细胞内基因编程所控制。外界刺激经过复杂的信号传导系统进入细胞核，作用于细胞凋亡相关基因，如P53、Fas、Bcl-2等基因启动了细胞凋亡相关程序，诱导细胞凋亡。诱导细胞凋亡研究手段已经作为筛选抗肿瘤药物的一种有效方法。我研究小组对AHCSE的体内外抗肿瘤实验研究已初步证实了其可诱导肝癌细胞凋亡，对肝癌细胞有明显的抑制作用。因而为AHCSE最终应用于临床提供一定的理论依据。        肝癌是一种严重危及人类健康的恶性程度较高的肿瘤，且对放化疗不甚敏感，有必要寻找另类新的作用靶点的治疗方法。本实验结果初步显示，AHCSE可能成为一种新的肝癌细胞凋亡的诱导剂。【参考文献】    1  程明荣，芮景，徐永强，等.蛇毒抗高凝状态酶抑制小鼠肝癌H22生长作用的实验研究.皖南医学院学报，2003，22（4）：256-259.        2  程明荣，芮景，徐永强，等.不同剂量蛇毒抗高凝状态酶对小鼠肝癌H22生长作用的实验研究.中国临床药理学与治疗学，2004，9(2)：157-161.        3  司徒镇强，吴军正.细胞培养.西安：世界图书出版公司，1996，131.        4  章良，吴梧桐.蛇毒抗肿瘤组分的研究进展.动物学杂志，2003，38(6)：120-124.        5  李红良，任先达，罗芙儒，等.中华眼镜蛇毒口服血清制剂对HepGl细胞凋亡的影响.中华病理生理杂志，2002，18（2）：121-200.        6  罗肖萍，赵路宁，管锦霞，等.眼镜蛇毒及其组分C对小鼠实验性肝癌作用的病理学研究.蛇志，1999，11(3)：10-15.        7  Da Silva RJ，Da Silva MG，Vilela L， et al. Antitumor effect of bothrops jararaca venom. Mediators Inflamm，2002，11(2)：99-104.        8  李钦章，黄沿中，杨冠群.眼镜蛇膜毒素与单克隆抗体偶连物对鼻咽癌细胞的特异性杀伤作用.暨南大学学报，1998，19(3)：94-99.        9  董庆华，郑树，吕庆华，等.浙江蝮蛇毒诱导人白血病Jurkat细胞凋亡的体外实验研究.中国中西医结合杂志，2002，22(11)：851-853.

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