2.2  LPS和组织胺对体单层HUVECs通透性的影响  见图3。    2.3  LPS对内皮细胞凋亡/坏死的影响  细胞经AO-EB染色，在激光共聚焦显微镜下观察，健康活细胞的胞核呈绿色网状结构，胞浆有红-橙色颗粒；凋亡细胞可见细胞收缩变圆，整个细胞呈均匀的绿色；坏死细胞则呈明亮的红色。结果显示，对照组细胞生长正常，无凋亡和坏死细胞出现（图4），而100μg/L LPS处理后凋亡细胞增多，并可出现坏死细胞（图5）。图4 对照组细胞经AO-EB染色，可见细胞后，可见生长正常，无凋亡或坏死细胞。40×图5  100μg/ml LPS处理内皮细胞部分凋亡晚期或坏死细胞。40×    3  讨论        LPS是革兰阴性细菌合成释放的主要毒素，是导致感染性休克的最重要的生物因子。内皮细胞是其主要的作用靶细胞之一，而肺、肠是最易受到攻击的靶器官［2，3］。受到攻击的肺微血管通透性增加是其重要特征，其机制与LPS导致的中性粒细胞粘附、积聚并释放各种炎性介质有关［4］，可导致肺水肿，引起低氧血症甚至ARDS，从而加重病情和病死率［5］。肠黏膜屏障功能受损导致肠壁水肿，毒素吸收增加和细菌移位，可能是导致肠源性感染的重要原因，有人报道肠通透性增加与胰腺炎预后有关［6］。        本实验也证实，LPS可增加肺和肠微血管内皮细胞通透性，其中以肺为明显，可能与肺血流量大和肺微血管内皮细胞敏感性高有关。结果显示，LPS对肠微血管通透性的影响与剂量和时间相关，10mg/kg LPS作用后2h后其通透性即显著增加，而5mg/kg剂量反使其通透性降低，12h后方明显增加，其机制不详，可能与低剂量内毒素血症时肠血流量过度减少、微血管内皮细胞损伤相对较轻有关，也可能与内皮细胞通透性改变的组织特异性有关。实验中还发现，LPS可引起肺肉眼可见的充血和出血，并可见气道内大量积液。        由于在体研究内皮细胞通透性十分困难，目前研究结果主要来自动物及体外细胞实验，利用干组织伊文氏蓝含量法测定微血管通透性可消除组织血流量差异带来的误差，能较为客观的反映微血管内皮细胞的通透性改变，是一种较为理想的方法［7］。过去国内外多将细胞接种于处理过的多聚碳酸微孔纤维滤膜等方法测定体外单层内皮细胞通透性，存在测定过程中需施加额外压力等人为因素，较为繁琐［8］。本实验采用预先包被胶原的商售Transwell Insert，其微孔滤膜透光，可镜下直接观察细胞生长情况，使用简单，结果较为可靠，是近年来国外普遍采用的单层内皮细胞通透性测定方法［9］。        既往的研究已证实，凋亡可能是LPS作用后内皮细胞通透性增加的原因这一［10］，本实验也显示，100μg/L LPS时引起内皮细胞最大通透性效应，与文献报道基本一致［11］，同时该剂量引起明显的内皮细胞凋亡效应，进一步提示凋亡在通透性增加中的可能作用，其确切机制有待进一步研究。        (本文图片见附页1)【参考文献】    1  Jaffe EA， Nachman RL， Becker CG， et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins： identification by morphological criteria.J Clin Invest，1973 (52)： 2745-2756.        2  DeLorme MP， Gao X， Doyon-Reale N，et al.Inflammatory effects of inhaled endotoxin-contaminated metal working fluid aerosols in rats.J Toxicol Environ Health A，2003，66(1)：7-24.        3  Yamada T， Inui A， Hayashi N，et al.Serotonin stimulates endotoxin translocation via 5-HT3 receptors in the rat ileum.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003，284.        4  Chignard M，Balloy V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279： 1083-1090.         5  Steven MD，Joe GN. Cytoskeletal regulation of pulmonary vascular permeability. J Appl Physiol， 2001，91： 1487-1500.        6  Basil JA，Paul CL，Roderick E GJ， et al. Early increase in intestinal permeability in patients with severe acute pancreatitis： correlation with endotoxemia， organ failure， and mortality. J Gastrointestinal Surgery， 1999，3：252-262.        7Lindblom L， Cassutoa J，Yregaêrd L， et al. Role of vasoactive intestinal polypeptide in burn-induced oedema formation. Burns，2000，26：443-448.        8  肖贞良，孙耕耘，夏前明，等.肿瘤坏死因子致肺血管内皮细胞单层通透性损伤的实验研究.中国应用生理学杂志，2001，17（1）：79-81.        9  Nooteboom A， Hendriks T，Otteholler I， et al. Permeability characteristics of human endothelial monolayers seeded on different extracellular matrix proteins. Mediators Inflamm，2000，9(5)：235-241.        10  Hsien CL， Jenine KA，Steven DH，et al. Dual effects of morphine on permeability and apoptosis of vascular endothelial cells： morphine potentiates lipopolysaccharide-induced permeability and apoptosis of vascular endothelial cells. Journal of Neuroimmunology， 2004，146： 13-21.        11  石富胜，徐根贤，王利平，等.内毒素、烧伤病人血清诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的体外实验研究.中华创伤杂志，2000，16（10）：600-602.

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