杂交液和杂交液。由于采用带正电荷的尼龙膜为支持介质，在碱性条件下更有利于DNA与膜结合，而预杂交的目的是封闭膜上的非特异性结合部位，因此预杂交液采用pH7.5的PB配制并调终体积；而杂交液中的探针要尽量减少与膜的非特异性杂交，因此杂交液用水来调终体积，pH值控制在6.5左右。同时，对杂交过程中所涉及的每一个步骤及试剂的配制，我们都进行优化，最终所确立优化过程如下：采用自配的预杂交液和杂交液，杂交液中探针浓度为10ng/ml，杂交后洗涤液1和2各洗涤2次，每次10min，5%的BSA封闭液封闭50min，封闭后加酶稀释比为1／5000，封闭后洗涤液洗2次，每次20min，检测缓冲液平衡10min，显色以出现阳性信号，本底最低为标准。    　图1  不同的探针及酶浓度进行假杂交反应    A：探针浓度为200ng/ml，酶浓度为1/400    B：探针浓度为100ng/ml，酶浓度为1/800    C：探针浓度为50ng/ml，酶浓度为1/2000    D：探针浓度为10ng/ml，酶浓度为1/5000 　　　   图2  三种不同BSA浓度显色对比    (A：BSA为5%；B：BSA为3%；C：BSA为2%)    图3  不同洗涤、封闭和显色时间的显色对比    A：条件1；B：条件2；C：条件3    图4  7901、NIH3T3、NB4和K562四种细胞的斑点杂交图    图示1～6稀释比例为1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32，每点cDNA上样量为12μl，原始浓度折算成RNA为2.4μg，采用寡核苷酸探针与之杂交                                              图5  不同细胞株pp-GalNAcT2的RT-PCR电泳图谱，其中1：NIH3T3细胞；2：SGC7901细胞；3：NB4细胞；4：K562细胞；M：marker；MG：β微球蛋白(内对照)    Fig6  RT-PCR analysis of pp-Ga1NAcT2 expression in SGC7901，K562，NB4 and NIH3T3 cells    为进一步检验膜杂交条件的可行性，我们用胃腺癌SGC7901细胞、白血病K562、NB4细胞和NIH3T3成纤维细胞的cDNA以一定的稀释比进行斑点杂交，检测pp-GalNAcT2在这四种细胞中的差异表达，得到的相对表达水平为：K562白血病细胞>胃癌细胞SGC7901>NB4白血病细胞，在NIH3T3成纤维细胞中未检测到表达。pp-GalNAcT2主要表达于富含粘蛋白的组织细胞中［3］，一般说来，能分泌较多粘蛋白的细胞pp-GalNAcT2有较高表达，如正常胃和大肠粘膜，胃癌细胞株SGC7901中pp-GalNAcT2 mRNA的表达很高是可以理解的；NIH3T3是一种成纤维细胞，来源    于非上皮组织，不分泌粘蛋白，所以其pp-GalNAcT2的表达甚低。K562和NB4均是白血病细胞，其pp-GalNAcT2表达也较高，其确切的生物学意义有待阐明。虽然我们采用了严谨的洗涤条件但也不排除杂交液中的探针与cDNA之间发生非特异性杂交，因此对每种细胞的cDNA行pp-GalNAcT2特异的RT-PCR，以β-MG为内对照，对所得的T2和β-MG条带扫描定量，比较四种细胞T2的相对表达高低，结果是与斑点杂交一致，证明斑点杂交结果是可信的，其杂交条件是可行的。另外，RT-PCR中检测到在NIH3T3细胞中有微量的T2表达，而在斑点杂交中未检出，说明显    色法斑点杂交在检测低表达基因的灵敏度上可能还不够，可能需要增加上样量或换用灵敏度更高的显影或检测系统来检测低表达基因的表达水平。但是，增加cDNA上样量会带来相当多的问题，主要是RNA的逆转录的效率，因为增加cDNA上样量必然需要增加逆转录所需的RNA用量。当然，也可以通过几管cDNA浓缩获得，但操作相对烦琐。另外，可以直接做RNA的斑点杂交，这样增加RNA上样量相对容易，但RNA容易降解，操作要求高，复杂，不如cDNA的斑点杂交简便，因此，相对可行的方法可能是根据实验所需，采用所建立的cDNA斑点杂交体系，用不同灵敏度的检测系统，如化学发光法、同位素标记法或荧光标记法等检测不同的基因表达。    总之，我们成功地建立了cDNA斑点杂交体系，无需特殊的仪器设备，试剂成本低廉；阳性信号清晰，结果可靠，有助于在基因的差异表达等研究中的应用。    【参考文献】    1  J.萨姆布鲁克， E.F.弗里特， T.曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 北京:科学出版社，1993，362-395.    2  http://www.superarray.com.    3  Kudo T， Ikehara Y， Togayachi A， et al.Up-regulation of a set glycosyl transferase genes in human colorectal cancer. Lab Invest，1998，78(7):797-811.

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